测定平菇中吲哚乙酸氧化酶活性的方法技术

本发明专利技术公开了一种测定平菇中吲哚乙酸氧化酶活性的方法，利用磷酸缓冲液提取样品中的吲哚乙酸氧化酶，向样品提取中加入混合反应试剂进行酶促反应，然后采用分光光度计测定平菇样品的吸光值，通过该吸光值计算平菇样品中吲哚乙酸氧化酶的活性。本发明专利技术充分利用吲哚乙酸在高氯酸环境中与三价铁离子生成红色络合物的原理，利用分光光度计法测定酶促反应液中吲哚乙酸在530nm处的吸光值，该方法不仅操作简单、成本低，还具有较高的灵敏度和检测精度，为研究吲哚乙酸氧化酶对平菇生长发育机制的影响提供了研究基础，也为吲哚乙酸氧化酶对其它食用菌（如香菇、草菇、金针菇等）生长发育机制的研究提供技术参考。

Determination of indoleacetate oxidase activity in Pleurotus ostreatus

【技术实现步骤摘要】
测定平菇中吲哚乙酸氧化酶活性的方法
本专利技术涉及平菇中吲哚乙酸氧化酶活性的测定，尤其是涉及一种测定平菇中吲哚乙酸氧化酶活性的方法。
技术介绍
平菇（Pleurotusostreatus）学名侧耳，又名北风菌、冻菌、蚝菌、鲍鱼菇等，其味道鲜美、营养丰富、具有很高的食用价值，目前已经在我国很多地区得到了大面积栽培。平菇的生长发育周期包括菌丝生长阶段和子实体生长阶段，平菇发育周期的长短是影响平菇栽培成本高低的重要因素，现有平菇生长发育相关的研究主要集中在外界环境因子（如光照、温度和氧气等）。吲哚乙酸（即IAA）作为一种重要的植物激素，其影响细胞分裂、伸长和分化，也影响营养器官和生殖器官的生长、成熟和衰老，即其在植物体内的代谢对维持植物体激素水平、调节特定的生理活动有着重要意义。研究表明，吲哚乙酸氧化酶（IAAO）对吲哚乙酸的代谢起关键作用，其通过调控植物体内吲哚乙酸的水平来调控复杂的植物生长，从而调节植物体的生长节律。因而，探讨吲哚乙酸的作用机制对深入研究平菇生长发育的生理过程有着重要意义。目前，植物体内IAAO的测定方法是利用试剂盒进行检测，然而由于植物与食用菌存在较大本质的区别，植物IAAO检测试剂盒不能有效检测平菇中IAAO的活性。因而，如何提供一种有效检测平菇中IAAO活性的方法是本领域技术人员研究的重要问题。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供一种测定平菇中吲哚乙酸氧化酶活性的方法，该方法操作简单，分析速度快，灵敏度高且可重复性好。为实现上述目的，本专利技术采取下述技术方案：本专利技术所述的测定平菇中吲哚乙酸氧化酶活性的方法，采用分光光度计测定平菇样品的吸光值，通过该吸光值计算平菇样品中吲哚乙酸氧化酶的活性，具体步骤如下：第一步，称取平菇样品于无菌研钵中，向无菌研钵中快速加入5～10mL预冷的pH=6.1磷酸缓冲液，低温研磨，将研磨后的平菇样品浆液离心，弃沉淀，得到含有吲哚乙酸氧化酶的样品提取液；第二步，称取吲哚乙酸于烧杯中，用无水乙醇溶解后转移至容量瓶中，然后用蒸馏水定容，混匀，得到吲哚乙酸贮备液；将吲哚乙酸贮备液稀释得到不同浓度的吲哚乙酸标准溶液；第三步，移取第二步稀释得到的各吲哚乙酸标准溶液于不同的反应管内，以等体积的蒸馏水作为空白，然后向吲哚乙酸标准液和空白中分别加入显色液，混匀，恒温显色反应20～40min后使混合液呈红色，用分光光度计测定吲哚乙酸标准液的吸光值，以吲哚乙酸的浓度为横坐标，以吸光值为纵坐标，绘制吲哚乙酸标准曲线；第四步，移取第一步中的样品提取液于反应管内，以与样品提取液等体积的磷酸缓冲液为对照，向样品提取液和对照中分别加入混合反应试剂，混匀，恒温酶促反应20～40min，得到样品酶促反应液和对照反应液；第五步，移取第四步中的样品酶促反应液和对照反应液于反应管内，以蒸馏水为空白，分别加入显色液，混匀，恒温反应20～40min使反应液呈红色，用分光光度计测定各反应液的吸光值，根据第三步中绘制的吲哚乙酸标准曲线得到样品酶促反应液和对照反应液中吲哚乙酸的浓度，再利用下述公式计算平菇样品中吲哚乙酸氧化酶的活性：样品中吲哚乙酸氧化酶的活性（µmol/g/h）=（C对照－C样品）×VT×V/（W×t×V1×M）；式中，C对照是对照反应液中吲哚乙酸的浓度，µg/mL；C样品是样品酶促反应液中吲哚乙酸的浓度，µg/mL；VT为第一步中样品提取液的总体积，mL；V为第四步中反应提取液与混合反应试剂的总体积，mL；W为平菇样品的重量，g；V1为第四步中参加酶促反应的样品提取液体积，mL；t为第四步中酶促反应时间，h；M为吲哚乙酸的摩尔质量，175.18µg/µmol。优选地，所述第二步中吲哚乙酸母液的浓度为100μg/mL，所述吲哚乙酸标准液的浓度梯度为0.5μg/mL、1.0μg/mL、2.5μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、15μg/mL、20μg/mL和25μg/mL。优选地，所述第三步和第五步中的显色液均为由浓度为0.5M的FeCl3和35%高氯酸按照1:50的体积比配制而成的混合液。优选地，所述第四步中的混合反应试剂为由1mLMnCl2、1mL2,4-二氯酚、2mLIAA溶液和5mL、pH=6.1的磷酸缓冲液组成的混合液，其中MnCl2的浓度为1.0mM，2,4-二氯酚的浓度为1.0mM，IAA溶液的浓度为200μg/mL，磷酸缓冲液的浓度为0.02M。本专利技术优点在于利用预冷的pH=6.1的磷酸缓冲液（浓度为0.02M）作为提取溶剂，在低温条件下萃取，能够最大限度地溶解平菇样品中的吲哚乙酸氧化酶。本专利技术以MnCl2、2,4-二氯酚、IAA溶液和pH=6.1的磷酸缓冲液（浓度为0.02M）组成的混合液与样品提取液进行酶促反应，酶促反应时间短，以便于同时处理多个待检样品。本专利技术充分利用吲哚乙酸在高氯酸环境中与三价铁离子生成红色络合物的原理，利用分光光度计法测定酶促反应液中吲哚乙酸在530nm处的吸光值，该方法不仅操作简单、成本低，还具有较高的灵敏度和检测精度。本专利技术在测定时需要的样品量少，能够同时检测多个平菇样品中的吲哚乙酸氧化酶活性，分析速度快。本专利技术为研究吲哚乙酸氧化酶对平菇生长发育机制的影响提供研究基础；同时也为吲哚乙酸氧化酶对其它食用菌（如香菇、草菇、金针菇等）生长发育机制的研究提供技术参考。附图说明图1是本专利技术吲哚乙酸的标准曲线图。具体实施方式本专利技术所用的试剂为现有市售产品；本专利技术所用的平菇菌株P99为现有市售的常规平菇菌株，购于河南省农业科学院；本专利技术所用的风光光度计型号为LabTechBlueStarA。本专利技术所用显色液的配制方法为：称取1.351gFeCl3·6H2O于烧杯中，用少量蒸馏水溶解后转移至10mL容量瓶内，用蒸馏水定容，得到浓度为0.5M的FeCl3溶液；移取2mLFeCl3溶液和100mL的高氯酸混合后得到显色液，将显色液置于棕色玻璃瓶中避光保存，使用前摇匀。本专利技术所用的混合反应试剂为由1mLMnCl2、1mL2,4-二氯酚、2mLIAA溶液和5mL、pH=6.1的磷酸缓冲液组成的混合液，其中MnCl2的浓度为1.0mM，2,4-二氯酚的浓度为1.0mM，IAA溶液的浓度为200μg/mL，磷酸缓冲液的浓度为0.02M，其中各试剂的具体配制方法为：1.0mM的MnCl2溶液：称取19.8mgMnCl2·4H2O于烧杯中，用少量蒸馏水溶解后转移至100mL容量瓶内，用蒸馏水定容；1.0mM的2,4-二氯酚：称取16.3mg2,4-二氯酚于烧杯中，用少量蒸馏水溶解后转移至100mL容量瓶内，用蒸馏水定容；200μg/mL的IAA溶液：称取20mg吲哚乙酸与烧杯中，用少量无水乙醇溶解后转移至100mL容量瓶内，用蒸馏水定容；pH=6.1的磷酸缓冲液（浓度为0.02M）：分别称取8.34g磷酸二氢钾和0.87g磷酸氢二钾于烧杯中，用少量蒸馏水溶解后转移至1000本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种测定平菇中吲哚乙酸氧化酶活性的方法，其特征在于：采用分光光度计测定平菇样品的吸光值，通过该吸光值计算平菇样品中吲哚乙酸氧化酶的活性，具体步骤如下：/n第一步，称取平菇样品于无菌研钵中，向无菌研钵中快速加入3～10mL预冷的pH=6.1磷酸缓冲液，低温研磨，将研磨后的平菇样品浆液离心，弃沉淀，得到含有吲哚乙酸氧化酶的样品提取液；/n第二步，称取吲哚乙酸于烧杯中，用无水乙醇溶解后转移至容量瓶中，然后用蒸馏水定容，混匀，得到吲哚乙酸贮备液；将吲哚乙酸贮备液稀释得到不同浓度的吲哚乙酸标准溶液；/n第三步，移取第二步稀释得到的各吲哚乙酸标准溶液于不同的反应管内，以等体积的蒸馏水作为空白，然后向吲哚乙酸标准液和空白中分别加入显色液，混匀，恒温显色反应20～40min后使混合液呈红色，用分光光度计测定吲哚乙酸标准液的吸光值，以吲哚乙酸的浓度为横坐标，以吸光值为纵坐标，绘制吲哚乙酸标准曲线；/n第四步，移取第一步中的样品提取液于反应管内，以与样品提取液等体积的pH=6.1磷酸缓冲液为对照，向样品提取液和对照中分别加入混合反应试剂，混匀，恒温酶促反应20～40min，得到样品酶促反应液和对照反应液；/n第五步，移取第四步中的样品酶促反应液和对照反应液于反应管内，以蒸馏水为空白，分别加入显色液，混匀，恒温反应20～40min使反应液呈红色，用分光光度计测定各反应液的吸光值，根据第三步中绘制的吲哚乙酸标准曲线得到样品酶促反应液和对照反应液中吲哚乙酸的浓度，再利用下述公式计算平菇样品中吲哚乙酸氧化酶的活性：/n样品中吲哚乙酸氧化酶的活性（µmol/g/h）=（C...

【技术特征摘要】
1.一种测定平菇中吲哚乙酸氧化酶活性的方法，其特征在于：采用分光光度计测定平菇样品的吸光值，通过该吸光值计算平菇样品中吲哚乙酸氧化酶的活性，具体步骤如下：
第一步，称取平菇样品于无菌研钵中，向无菌研钵中快速加入3～10mL预冷的pH=6.1磷酸缓冲液，低温研磨，将研磨后的平菇样品浆液离心，弃沉淀，得到含有吲哚乙酸氧化酶的样品提取液；
第二步，称取吲哚乙酸于烧杯中，用无水乙醇溶解后转移至容量瓶中，然后用蒸馏水定容，混匀，得到吲哚乙酸贮备液；将吲哚乙酸贮备液稀释得到不同浓度的吲哚乙酸标准溶液；
第三步，移取第二步稀释得到的各吲哚乙酸标准溶液于不同的反应管内，以等体积的蒸馏水作为空白，然后向吲哚乙酸标准液和空白中分别加入显色液，混匀，恒温显色反应20～40min后使混合液呈红色，用分光光度计测定吲哚乙酸标准液的吸光值，以吲哚乙酸的浓度为横坐标，以吸光值为纵坐标，绘制吲哚乙酸标准曲线；
第四步，移取第一步中的样品提取液于反应管内，以与样品提取液等体积的pH=6.1磷酸缓冲液为对照，向样品提取液和对照中分别加入混合反应试剂，混匀，恒温酶促反应20～40min，得到样品酶促反应液和对照反应液；
第五步，移取第四步中的样品酶促反应液和对照反应液于反应管内，以蒸馏水为空白，分别加入显色液，混匀，恒温反应20～40min使反应液呈红色，用分光光度计测定各反应液的吸光值，根据第三步中绘制的吲哚乙酸标准曲线得到样品酶促反应液和对照反应液中吲哚乙酸的浓度，再利用下述公式计算平菇样品中吲哚乙酸氧化酶的活性：
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【专利技术属性】
技术研发人员：崔筱，孔维丽，张玉亭，康源春，袁瑞奇，孔维威，刘芹，胡素娟，段亚魁，宋志波，韩玉娥，
申请(专利权)人：河南省农业科学院植物营养与资源环境研究所，河南信念现代农业产业研究院，
类型：发明
国别省市：河南;41