红椿的内参基因及其引物和应用制造技术

本发明专利技术公开了红椿的内参基因及其引物和应用。本发明专利技术筛选出在红椿4℃胁迫下的内参基因60s‑L18和CYP95，茉莉酸甲酯(MeJA)胁迫下的内参基因UBC17和CYP95，干旱胁迫下的内参基因PP2C57和EF1‑α，红椿不同组织部位的内参基因18S rRNA和TUBα‑3，利用筛选的内参基因，可提高红椿相关基因表达量分析研究的稳定性和可靠性，填补了红椿研究领域中缺少内参基因的空白。

The internal reference gene of Toona sinensis and its primer and Application

【技术实现步骤摘要】
红椿的内参基因及其引物和应用
本专利技术属于植物基因工程
，具体涉及红椿的内参基因及其引物和应用。
技术介绍
红椿(Toonaciliata)，隶属楝科(Meliaceae)香椿属(Toona)，为国家Ⅱ级重点保护野生濒危植物，广泛分布于中国的华南、华中地区以及北亚热带的南缘。红椿树干通直，材质优良，心材红褐色，纹理优美，是建筑、家具、室内装饰良材，具有很大的开发潜力，素有“中国桃花心木”之称为。近年来，学者一方面致力于开发红椿潜在价值，如红椿的茎皮化合物、生物药学、精油、木材密度以及胁迫影响等；另一方面加大了对红椿栽培技术的研究，通过遗传多样性分析、自然种群动态分析、优树选育、种群分布、扦插、组织培养以及病害防治等技术研究，为红椿自然资源的繁育和保护提供科学依据。红椿的良种选育极其重要，现有研究多采用传统育种，耗时，费力且成效低等。红椿分子育种方面的研究极少，单一的育种模式大大的限制了红椿育种工作的推进。分子育种具有高效、针对性强、节省人力物力等特点，已被广泛应用于林木良种选育，其主要是探究基因表达的机理及作用途径，然后通过调控基因的表达改变植株性状，从而获得新品种。基因表达分析是植物分子生物学领域研究中重要手段之一，在探求基因模式、调控机理、揭示植物内部奥秘等方面有至关重要的作用。研究基因表达的方法有很多，如Northern，microarray，实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)和高通量测序等，其中荧光定量PCR应用最为广泛，它具有高灵敏度，准确性、特异性等特点，是监测整个PCR过程的有力工具。但是荧光定量结果通常受到多个错误来源的影响，如起始材料的量，RNA的完整性，逆转录和qRT-PCR扩增等。因此，为了获得准确的qRT-PCR分析结果，需要一个表达稳定的内参基因进行校正和标准化，从而控制样品内部和样品间不必要的误差。内参基因的表达具有时空特异性，没有一个内参基因可以在所有的试验条件下都能持续的稳定表达，因此内参基因的选取必须具有目的性，针对特定实验条件筛选出特定实验条件下表达稳定的基因才能保证实验结果的准确性和严谨性。目前，关于红椿内参基因的开发筛选的研究报道一片空白，若要对红椿特定胁迫条件下相关分子生物学机制进行研究，内参基因的开发和筛选至关重要。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术中缺少对红椿基因表达量分析的有效校正和标准化的内参基因的不足，提供红椿的内参基因及其引物和应用；通过分析红椿转录组数据，进行内参基因的开发；选取红椿在4℃胁迫、茉莉酸甲酯(MeJA)胁迫、PEG6000干旱胁迫及红椿不同部位的内参基因的筛选和验证，获得适用于红椿在不同条件下的内参基因及其引物，克服了传统看家基因的基因的缺点和不足。因此，本专利技术的第一个目的是提供低温胁迫下红椿的内参基因，为内参基因60s-L18和CYP95，所述的内参基因60s-L18的核苷酸序列如SEQIDNO.15所示，所述的内参基因CYP95的核苷酸序列如SEQIDNO.16所示。本专利技术还提供所述的低温胁迫下红椿的内参基因的特异性引物，所述的内参基因60s-L18的正向引物和反向引物分别如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示，所述的内参基因CYP95的正向引物和反向引物分别如SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示。因此，本专利技术的第二个目的是提供茉莉酸甲酯胁迫下红椿的内参基因，为内参基因UBC17和CYP95，所述的内参基因UBC17的核苷酸序列如SEQIDNO.17所示，所述的内参基因CYP95的核苷酸序列如SEQIDNO.16所示。本专利技术还提供所述的茉莉酸甲酯胁迫下红椿的内参基因的特异性引物，所述的内参基因UBC17的正向引物和反向引物分别如SEQIDNO.5和SEQIDNO.6所示，所述的内参基因CYP95的正向引物和反向引物分别如SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示。因此，本专利技术的第三个目的是提供干旱胁迫下红椿的内参基因，为内参基因PP2C57和EF1-α，所述的内参基因PP2C57的核苷酸序列如SEQIDNO.18所示，所述的内参基因EF1-α的核苷酸序列如SEQIDNO.19所示。本专利技术还提供所述的干旱胁迫下红椿的内参基因的特异性引物，所述的内参基因PP2C57的正向引物和反向引物分别如SEQIDNO.7和SEQIDNO.8所示，所述的内参基因EF1-α的正向引物和反向引物分别如SEQIDNO.9和SEQIDNO.10所示。因此，本专利技术的第四个目的是提供红椿不同组织部位的内参基因，为内参基因18SrRNA和TUBα-3，所述的内参基因18SrRNA的核苷酸序列如SEQIDNO.20所示，所述的内参基因TUBα-3的核苷酸序列如SEQIDNO.21所示。本专利技术还提供所述的红椿不同组织部位的内参基因的特异性引物，所述的内参基因18SrRNA的正向引物和反向引物分别如SEQIDNO.11和SEQIDNO.12所示，所述的内参基因TUBα-3的正向引物和反向引物分别如SEQIDNO.13和SEQIDNO.14所示。本专利技术还提供所述的内参基因或所述的特异性引物的应用。优选，所述的应用，为所述的内参基因或所述的特异性引物在制备荧光定量试剂盒中的应用。本专利技术通过选取红椿在4℃胁迫、茉莉酸甲酯(MeJA)胁迫、PEG6000干旱胁迫及不同部位的样品；利用红椿转录组数据，筛选出红椿的候选内参基因；以候选内参基因的序列为模板，设计实时荧光定量PCR的内参基因扩增引物；进行实时荧光定量PCR；通过△Ct、GeNorm、NormFinder、BestKeeper对获得的荧光定量PCR数据进行统计分析，分别筛选出红椿在4℃胁迫、茉莉酸甲酯(MeJA)胁迫、PEG6000干旱胁迫及不同部位表达稳定的内参基因。本专利技术遵循荧光定量PCR引物设计的原则，进行跨内含子设计荧光定量PCR引物，引物扩增片段长度为100-200bp，这样设计的引物可以避免gDNA污染带来的实验误差，使实验数据更加准去可靠。相比于现有技术，本专利技术具有以下优点：(1)本专利技术从20个候选内参基因中筛选出红椿在4℃胁迫、茉莉酸甲酯(MeJA)胁迫、PEG6000干旱胁迫及不同部位表达稳定的内参基因，数据真实可靠，为红椿抗虫抗冻、抗干旱等响应机制的分子生物学研究提供校正工具，填补了红椿研究领域中缺少合适的内参基因的空白。(2)筛选出的内参基因适用于红椿在4℃胁迫、茉莉酸甲酯(MeJA)胁迫、PEG6000干旱胁迫及不同部位的关键基因的表达分析，可提高数据的准确性。(3)本专利技术提供的内参基因可以为香椿属其他植物的研究提供参考价值。附图说明图1是以红椿DNA为模板，候选内参基因gDNA片段电泳图；图2是以红椿cDNA为模板，候选内参基因CDS片段电泳图；图3是以红椿cDNA为模板，利用设计的候选内参基因荧光定量PCR引物扩增红椿cDNA产物电泳图；图4是所有候选内参基因利用对应的荧光定量PCR引物扩增后的熔解曲线；...

【技术保护点】
1.低温胁迫下红椿的内参基因，其特征在于，为内参基因60s-L18和CYP95，所述的内参基因60s-L18的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示，所述的内参基因CYP95的核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示。/n

【技术特征摘要】
1.低温胁迫下红椿的内参基因，其特征在于，为内参基因60s-L18和CYP95，所述的内参基因60s-L18的核苷酸序列如SEQIDNO.15所示，所述的内参基因CYP95的核苷酸序列如SEQIDNO.16所示。


2.权利要求1所述的低温胁迫下红椿的内参基因的特异性引物，其特征在于，所述的内参基因60s-L18的正向引物和反向引物分别如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示，所述的内参基因CYP95的正向引物和反向引物分别如SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示。


3.茉莉酸甲酯胁迫下红椿的内参基因，其特征在于，为内参基因UBC17和CYP95，所述的内参基因UBC17的核苷酸序列如SEQIDNO.17所示，所述的内参基因CYP95的核苷酸序列如SEQIDNO.16所示。


4.权利要求3所述的茉莉酸甲酯胁迫下红椿的内参基因的特异性引物，其特征在于，所述的内参基因UBC17的正向引物和反向引物分别如SEQIDNO.5和SEQIDNO.6所示，所述的内参基因CYP95的正向引物和反向引物分别如SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示。


5.干旱胁迫下红椿的内参基因，其特征在于，为内参基因PP2C57和EF1-α，所述的内参基因PP2C57的核苷酸序列如S...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋慧云，毛文迈，李培，段志豪，周玮，欧阳昆唏，陈晓阳，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：广东;44