【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】指导核酸的产生和用途交叉引用本申请要求2017年6月7日提交的美国临时专利申请序列号62/516,619和2017年8月21日提交的美国临时专利申请序列号62/548,036的优先权权益，其中的每个通过引用以其整体并入本文。背景人类临床DNA样品和样品文库诸如源自RNA的cDNA文库含有高丰度的几乎没有信息价值并且增加测序成本的序列。虽然已经开发了方法来消耗这些不想要的序列(例如，经由杂交捕获)，但是这些方法经常是耗时的并且可能效率低。尽管指导核酸(gNA)介导的核酸酶系统(诸如指导RNA(gRNA)介导的Cas系统)可有效地消耗任何靶DNA，但是靶向消耗极高数量的独特DNA分子是不可行的。例如，源自人类血液的测序文库可含有>99％人类基因组DNA。使用基于gRNA介导的Cas9系统的方法来消耗该基因组DNA以检测在人类血液中循环的感染源，会需要极高数量的gRNA(约10,000,000-100,000,000gRNA)，以确保每30-50个碱基对(bp)会存在gRNA，并且不会错过靶DNA。极大数量的gRNA可通过计算...
【技术保护点】
1.一种制备核酸的集合的方法，其包括：/na.获得靶核酸，每个靶核酸包含核酸指导的核酸酶的PAM位点；/nb.使第一引物与所述靶核酸的PAM位点杂交，其中所述第一引物包含(i)与所述PAM位点互补的MAP位点，(ii)与所述核酸指导的核酸酶的识别位点互补的互补识别位点，和(iii)与启动子位点互补的互补启动子位点；/nc.使用所述靶核酸作为模板延伸所述第一引物，由此产生包含所述第一引物的序列和与所述靶核酸互补的序列的第一延伸产物；/nd.使第二引物与所述第一延伸产物杂交；和/ne.使用所述第一延伸产物作为模板延伸所述第二引物，由此产生包含所述PAM位点、所述识别位点和所述启...
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170607 US 62/516,619;20170821 US 62/548,0361.一种制备核酸的集合的方法，其包括：
a.获得靶核酸，每个靶核酸包含核酸指导的核酸酶的PAM位点；
b.使第一引物与所述靶核酸的PAM位点杂交，其中所述第一引物包含(i)与所述PAM位点互补的MAP位点，(ii)与所述核酸指导的核酸酶的识别位点互补的互补识别位点，和(iii)与启动子位点互补的互补启动子位点；
c.使用所述靶核酸作为模板延伸所述第一引物，由此产生包含所述第一引物的序列和与所述靶核酸互补的序列的第一延伸产物；
d.使第二引物与所述第一延伸产物杂交；和
e.使用所述第一延伸产物作为模板延伸所述第二引物，由此产生包含所述PAM位点、所述识别位点和所述启动子位点的第二延伸产物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述第二引物包含(i)所述核酸指导的核酸酶的PAM位点和(ii)随机序列。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述随机序列的长度介于约6个与约8个碱基之间。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一引物进一步包含限制酶的限制酶位点。
5.根据权利要求1所述的方法，进一步包括：
f.使衔接子与所述第二延伸产物连接，其中所述衔接子包含限制酶的限制酶位点；和
g.用所述限制酶切割所述第二延伸产物，使得从所述识别位点切割所述PAM位点和所述限制位点。
6.根据权利要求4或权利要求5所述的方法，其中所述限制酶包含MmeI、FokI或MlyI。
7.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括去除未结合的第一引物或未结合的第二引物。
8.根据权利要求1所述的方法，其中延伸所述第一引物或延伸所述第二引物是用标记的核苷酸进行的。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述标记的核苷酸包含生物素化的核苷酸。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述识别位点的长度为约20个核苷酸。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述识别位点的长度为约15至约25个核苷酸。
12.根据权利要求1所述的方法，其中所述核酸指导的核酸酶包含Cas系统蛋白。
13.根据权利要求1所述的方法，其中所述核酸指导的核酸酶包含Cas9系统蛋白。
14.根据权利要求1所述的方法，其中所述靶核酸包含基因组DNA或cDNA。
15.根据权利要求1所述的方法，其中所述靶核酸包含人DNA。
16.根据权利要求1所述的方法，其中所述靶核酸包含宿主DNA。
17.根据权利要求1所述的方法，其中所述靶核酸包含真核生物DNA。
18.根据权利要求1所述的方法，其中所述互补识别位点包含至少一个修饰的核酸键。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述修饰的核酸键选自锁核酸(LNA)、桥连核酸(BNA)、肽核酸(PNA)、拉链核酸(ZNA)、乙二醇核酸(GNA)、苏糖核酸(TNA)和硫代磷酸(PTO)。
20.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括使用所述启动子位点转录所述第二延伸产物。
21.一种制备核酸的集合的方法，其包括：
a.获得靶核酸，每个靶核酸包含核酸指导的核酸酶的PAM位点；
b.使引物与所述靶核酸的PAM位点杂交，其中所述引物包含(i)与所述PAM位点互补的MAP位点，(ii)与所述核酸指导的核酸酶的识别位点互补的互补识别位点，和(iii)与启动子位点互补的互补启动子位点；
c.使用所述靶核酸作为模板延伸所述引物，由此产生包含所述PAM位点、所述识别位点和所述启动子位点的延伸产物；
d.使所述靶核酸产生切口；和
e.消化有切口的靶核酸。
22.根据权利要求21所述的方法，其进一步包括使所述延伸产物与包含所述核酸指导的核酸酶的茎环序列的核酸或其互补物连接。
23.根据权利要求21所述的方法，其进一步包括向所述延伸产物添加错列的双链茎环。
24.根据权利要求21所述的方法，其进一步包括使用所述启动子位点转录所述延伸产物。
25.根据权利要求21所述的方法，其进一步包括去除未结合的引物。
26.根据权利要求21所述的方法，其中延伸所述引物是用标记的核苷酸进行的。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述标记的核苷酸包含生物素化的核苷酸。
28.根据权利要求21所述的方法，其中所述互补识别位点的长度为约20个核苷酸。
29.根据权利要求21所述的方法，其中所述互补识别位点的长度为约15至约25个核苷酸。
30.根据权利要求21所述的方法，其中所述核酸指导的核酸酶包含Cas系统蛋白。
31.根据权利要求21所述的方法，其中所述核酸指导的核酸酶包含Cas9系统蛋白。
32.根据权利要求21所述的方法，其中所述靶核酸包含基因组DNA或cDNA。
33.根据权利要求21所述的方法，其中所述靶核酸包含人DNA。
34.根据权利要求21所述的方法，其中所述靶核酸包含宿主DNA。
35.根据权利要求21所述的方法，其中所述靶核酸包含真核生物DNA。
36.根据权利要求21所述的方法，其中所述互补识别位点包含至少一个修饰的核酸键。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述修饰的核酸键选自锁核酸(LNA)、桥连核酸(BNA)、肽核酸(PNA)、拉链核酸(ZNA)、乙二醇核酸(GNA)、苏糖核酸(TNA)和硫代磷酸(PTO)。
38.一种制备核酸的集合的方法，其包括：
a.获得靶核酸，每个靶核酸包含核酸指导的核酸酶的PAM位点；
b.使第一环衔接子与所述靶核酸的两端连接，其中所述第一环衔接子包含启动子位点；
c.在所述PAM位点处切割靶核酸，由此产生DNA切割产物，每个DNA切割产物包含在第一端处的第一环衔接子之一和第二端处的PAM位点；
d.使第二环衔接子与所述切割产物的第二端连接，其中所述第二环衔接子包含与所述核酸指导的核酸酶的茎环序列互补的互补茎环序列；和
e.扩增所述切割产物，由此产生包含所述启动子位点、识别位点和所述茎环序列的扩增产物，其中所述识别位点包含与所述靶核酸之一中的PAM位点邻近的序列。
39.一种制备指导核酸的集合的方法，其包括：
a.获得靶核酸的序列读段；
b.将序列读段映射到至少一个参考序列；
c.测定所述序列读段的丰度值；
d.从所述序列读段中鉴定识别位点，其中所述识别位点与核酸指导的核酸酶的PAM位点邻近；和
e.基于所述丰度值分选所述识别位点。
40.根据权利要求39所述的方法，其进一步包括合成所述指导核酸的集合，其中所述指导核酸各自包含所述识别位点中的一个和所述核酸指导的核酸酶的茎环序列。
41.根据权利要求40所述的方法，其中所述指导核酸的集合包含具有前100个分选的识别位点、前1000个分选的识别位点或前10,000个分选的识别位点的指导核酸。
42.根据权利要求39所述的方法，其进一步包括过滤所述识别位点，使得所述识别位点在所述至少一个参考序列中彼此间隔至少100个碱基对、至少200个碱基对、至少500个碱基对或至少1000个碱基对。
43.根据权利要求39所述的方法，其中分选所述识别位点是通过分选所述序列读段进行的。
44.根据权利要求39所述的方法，其中所述识别位点包含约20个碱基。
45.根据权利要求39所述的方法，其中所述核酸指导的核酸酶包含Cas系统蛋白。
46.根据权利要求39所述的方法，其中所述核酸的靶位点位于所述PAM位点的5’，且其中所述识别位点是所述茎环序列的5’。
47.根据权利要求46所述的方法，其中所述PAM位点包含NGG或NAG。
48.根据权利要求47所述的方法，其中所述核酸指导的核酸酶包含Cas9系统蛋白。
49.根据权利要求39所述的方法，其中所述核酸的靶位点位于所述PAM位点的3’，且其中所述识别位点是所述茎环序列的3’。
50.根据权利要求49所述的方法，其中所述PAM位点包含TTN、TCN或TGN。
51.根据权利要求50所述的方法，其中所述核酸指导的核酸酶包含Cpf1系统蛋白。
52.根据权利要求39所述的方法，其中所述核酸指导的核酸酶包含Cas9系统蛋白。
53.根据权利要求39所述的方法，其中所述靶核酸包含基因组DNA或cDNA。
54.根据权利要求39所述的方法，其中所述靶核酸包含人DNA。
55.根据权利要求39所述的方法，其中所述靶核酸包含宿主DNA。
56.根据权利要求39所述的方法，其中所述靶核酸包含真核生物DNA。
57.根据权利要求39所述的方法，其进一步包括使所述指导核酸与基质结合。
58.根据权利要求57所述的方法，其中所述基质包含流动池、流体通道、微流体通道或珠。
59.一种制备指导核酸的集合的方法，其包括：
a.获得靶核酸的序列读段；
b.从所述序列读段中确定最常见的识别位点，其中识别位点与核酸指导的核酸酶的PAM位点邻近；
c.从所述序列读段中确定下一最常见的识别位点；和
d.重复步骤c直至条件被满足，其中所述条件选自(i)确定一定数目的识别位点，(ii)无法确定另外的识别位点，(iii)一定百分比的靶核酸被所述识别位点覆盖，和(iv)在所述识别位点处或在所述识别位点附近切割所述靶核酸产生低于一定大小的最大片段大小。
60.根据权利要求59所述的方法，其中所述一定数目的识别位点为至少约100个、至少约1000个或至少约10,000个。
61.根据权利要求59所述的方法，其中所述一定百分比为至少约10％、至少约30％、至少约50％、至少约70％、至少约90％、至少约95％或至少约99％。
62.根据权利要求59所述的方法，其中所述一定大小为至多约1000bp、至多约500bp、至多约200bp或至多约100bp。
63.根据权利要求59所述的方法，其进一步包括合成指导核酸的集合，其中所述指导核酸各自包含所述识别位点中的一个和所述核酸指导的核酸酶的茎环序列。
64.根据权利要求59所述的方法，其中所述识别位点包含约20个碱基。
65.根据权利要求59所述的方法，其中所述核酸指导的核酸酶包含Cas系统蛋白。
66.根据权利要求59所述的方法，其中所述核酸的靶位点位于所述PAM位点的5’，且其中所述识别位点是所述茎环序列的5’。
67.根据权利要求66所述的方法，其中所述PAM位点包含NGG或NAG。
68.根据权利要求67所述的方法，其中所述核酸指导的核酸酶包含Cas9系统蛋白。
69.根据权利要求59所述的方法，其中所述核酸的靶位点位于所述PAM位点的3’，且其中所述识别位点是所述茎环序列的3’。
70.根据权利要求69所述的方法，其中所述PAM位点包含TTN、TCN或TGN。
71.根据权利要求70所述的方法，其中所述核酸指导的核酸酶包含Cpf1系统蛋白。
72.根据权利要求59所述的方法，其中所述靶核酸包含基因组DNA或cDNA。
73.根据权利要求59所述的方法，其中所述靶核酸包含人DNA。
74.根据权利要求59所述的方法，其中所述靶核酸包含宿主DNA。
75.根据权利要求59所述的方法，其中所述靶核酸包含真核生物DNA。
76.根据权利要求59所述的方法，其进一步包括所述指导核酸与基质结合。
77.根据权利要求76所述的方法，其中所述基质包含流动池、流体通道、微流体通道或珠。
78.一种包含指导核酸的集合的组合物，
其中每个指导核酸包含识别位点和核酸指导的核酸酶的茎环序列，
其中每个识别位点与与所述核酸指导的核酸酶的PAM位点邻近的靶核酸的靶位点互补，且
其中与所述指导核酸的集合的识别位点互补的靶位点以小于约10,000个碱基对的平均间隔分布在所述靶核酸内。
79.根据权利要求78所述的组合物，其中所述平均间隔为小于约5,000个碱基对、小于约2,500个碱基对、小于约1,000个碱基对、小于约500个碱基对、小于约250个碱基对或小于约100个碱基对。
80.根据权利要求78所述的组合物，其中所述指导核酸的集合包含具有至少约100个不同识别位点、至少1,000个不同识别位点、至少10,000个不同识别位点、至少100,000个不同识别位点或至少1,000,000个不同识别位点的指导核酸。
81.根据权利要求78所述的组合物，其中所述识别位点包含约20个碱基。
82.根据权利要求78所述的组合物，其中所述核酸的靶位点位于所述PAM位点的5’，且其中所述识别位点是所述茎环序列的5’。
83.根据权利要求82所述的组合物，其中所述PAM位点包含NGG或NAG。
84.根据权利要求83所述的组合物，其中所述核酸指导的核酸酶包含Cas9系统蛋白。
85.根据权利要求78所述的组合物，其中所述核酸的靶位点位于所述PAM位点的3’，且其中所述识别位点是所述茎环序列的3’。
86.根据权利要求85所述的组合物，其中所述PAM位点包含TTN、TCN或TGN。
87.根据权利要求86所述的组合物，其中所述核酸指导的核酸酶包含Cpf1系统蛋白。
88.根据权利要求78所述的组合物，其中所述靶核酸包含基因组DNA或cDNA。
89.根据权利要求78所述的组合物，其中所述靶核酸包含人DNA。
90.根据权利要求78所述的组合物，其中所述靶核酸包含宿主DNA。
91.根据权利要求78所述的组合物，其中所述靶核酸包含真核生物DNA。
92.根据权利要求78所述的组合物，其中所述指导核酸与基质结合。
93.根据权利要求92所述的组合物，其中所述基质包含流动池、流体通道、微流体通道或珠。
94.一种消耗靶核酸的方法，其包括：
a.获得包含靶核酸和非靶核酸的核酸；和
b.使所述靶核酸与与权利要求78-91中任一项所述的指导核酸的集合复合的核酸指导的核酸酶的复合物接触，使得所述靶核酸在所述靶位点处或靶位点附近被切割。
95.根据权利要求94所述的方法，其中所述非靶核酸包含免疫应答信号核酸。
96.根据权利要求94所述的方法，其中所述非靶核酸包含细胞凋亡信号核酸。
97.根据权利要求94所述的方法，其中所述非靶核酸包含癌症相关的细胞凋亡信号核酸。
98.根据权利要求94所述的方法，其中所述核酸指导的核酸酶的复合物与基质结合。
99.根据权利要求98所述的方法，其中所述基质包含流动池、流体通道、微流体通道或珠。
100.一种消耗靶核酸的方法，其包括：
a.获得包含靶核酸和非靶核酸的核酸；
b.使所述核酸与核酸指导的切口酶蛋白-gNA复合物接触，使得所述靶核酸在切口位点处产生切口，且其中所述gNA包含5’茎环序列和3’导向序列；
c.在所述切口位点处进行切口平移，其中所述切口平移是用标记的核苷酸进行的；
d.用所述标记的核苷酸捕获所述靶核酸；和
e.从所述非靶核酸中分离所述靶核酸。
101.根据权利要求100所述的方法，其中所述标记的核苷酸包含生物素化的核苷酸。
102.根据权利要求100所述的方法，其中所述靶核酸是通过结合基质来捕获的。
103.根据权利要求102所述的方法，其中所述基质包含流动池、流体通道、微流体通道或珠。
104.根据权利要求100所述的方法，其进一步包括分析所述非靶核酸。
105.根据权利要求104所述的方法，其中所述分析包括测序。
106.根据权利要求104所述的方法，其中所述分析包括杂交。
107.根据权利要求100所述的方法，其中所述靶核酸来自宿主，且所述非靶核酸来自非宿主。
108.根据权利要求107所述的方法，其中所述非宿主包含传染剂。
109.根据权利要求100所述的方法，其中所述核酸指导的切口酶蛋白包含Cpf1系统切口酶蛋白。
110.根据权利要求109所述的方法，其中所述Cpf1系统切口酶蛋白包含从弗朗西丝菌属(Francisella)或氨基酸球菌属(Acidaminococcus)分离或衍生的Cpf1系统蛋白。
111.根据权利要求100所述的方法，其中所述靶核酸包含基因组DNA或cDNA。
112.根据权利要求100所述的方法，其中所述靶核酸包含人DNA。
113.根据权利要求100所述的方法，其中所述靶核酸包含真核生物DNA。
114.一种消耗靶核酸的方法，其包括：
a.获得包含靶核酸和非靶核酸的核酸，其中所述核酸在第一端处包含发夹环；
b.使环衔接子与所述核酸的第二端杂交；
c.使所述核酸与核酸指导的切口酶蛋白接触，使得所述靶核酸是有切口的；和
d.消化有切口的靶核酸。
115.根据权利要求114所述的方法，其进一步包括切割所述非靶核酸的环衔接子。
116.根据权利要求115所述的方法，其中所述切割是在所述环衔接子的限制位点处进行的。
117.根据权利要求115所述的方法，其中所述切割是在所述环衔接子的核酸指导的核酸酶识别位点处进行的。
118.根据权利要求117所述的方法，其进一步包括分析所述非靶核酸。
119.根据权利要求118所述的方法，其中所述分析包括测序。
120.根据权利要求118所述的方法，其中所述分析包括杂交。
121.根据权利要求114所述的方法，其中所述消化是用外切核酸酶进行的。
122.根据权利要求114所述的方法，其中所述核酸指导的切口酶蛋白与基质结合。
123.根据权利要求122所述的方法，其中所述基质包含流动池、流体通道、微流体通道或珠。
124.一种制备测序文库的方法，其包括：
a.提供包含感兴趣的位点的DNA分子，该DNA分子是在经历了权利要求100-123中任一项所述的消耗方法或捕获方法之后所获得的；
b.封闭所述DNA分子的3’端，使得该3’端不能通过聚合酶被延伸；
c.使第一引物与所述DNA分子杂交；
d.延伸所述第一引物以产生延伸产物，该延伸产物包含所述第一引物的序列和所述感兴趣的位点的序列；
e.使第二引物与所述延伸产物杂交；和
f.使用所述第二引物来扩增所述延伸产物。
125.根据权利要求124所述的方法，其进一步包括，在使所述第二引物杂交之前，向所述延伸产物添加尾。
126.根据权利要求125所述的方法，其中所述第二引物与所述尾杂交。
127.根据权利要求124所述的方法，其进一步包括，在步骤d之后，重复步骤c和d。
128.根据权利要求124所述的方法，其进一步包括，在使第二引物杂交之前，去除未杂交的第一引物。
129.根据权利要求128所述的方法，其中所述去除包括消化。
130.根据权利要求129所述的方法，其中所述消化包括外切核酸酶消化。
131.根据权利要求128所述的方法，其中所述去除包括结合并入至所述延伸产物中的标记的核苷酸。
132.根据权利要求131所述的方法，其中所述标记的核苷酸包含生物素化的核苷酸。
133.根据权利要求124所述的方法，其中所述第一引物和/或所述第二引物包含测序衔接子序列。
134.根据权利要求124所述的方法，其中所述感兴趣的位点包含单核苷酸多态性(SNP)。
135.根据权利要求124所述的方法，其中所述感兴趣的位点包含短串联重复(STR)。
136.根据权利要求135所述的方法，其中所述STR是小STR。
137.一种制备测序文库的方法，其包括：
a.提供源自gNA消耗或捕获方法的RNA分子；
b.使第一杂交位点附着至所述RNA分子；
c.使第一寡核苷酸与所述第一杂交位点杂交；
d.使用所述第一寡核苷酸作为引物来反转录所述RNA分子的至少一部分，由此生成cDNA；
e.使第二寡核苷酸与所述cDNA的尾杂交；和
f.使用所述第二寡核苷酸和/或所述第一寡核苷酸作为引物来扩增所述cDNA。
138.根据权利要求137所述的方法，其中所述第一杂交位点包含尾。
139.根据权利要求137所述的方法，其中所述第一杂交位点包含聚A尾。
140.根据权利要求137所述的方法，其中所述第一寡核苷酸包含至少一个条形码序列。
141.根据权利要求137所述的方法，其中所述第二寡核苷酸包含至少一个条形码序列。
142.根据权利要求137所述的方法，其中所述第一寡核苷酸和/或所述第二寡核苷酸包含一个或多个选自下组的条形码序列：(i)指定RNA分子所独有的独特分子识别符序列，和(ii)在来自同一来源的RNA分子之间共享的来源条形码序列。
143.根据权利要求137所述的方法，其中所述第一寡核苷酸和/或所述第二寡核苷酸包含测序衔接子序列。<...
【专利技术属性】
技术研发人员：S·B·古尔格钦，M·L·卡彭特，M·拉斯穆森，S·拉德哈基什南，A·K·埃尔默，
申请(专利权)人：阿克生物公司，
类型：发明
国别省市：美国;US
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