视网膜组织的制备方法技术

本发明专利技术的课题在于提供抑制包含视细胞前体细胞和/或视细胞的神经视网膜组织中的神经节细胞、无长突细胞、水平细胞和/或双极细胞分化的方法等。一种抑制包含视细胞前体细胞和/或视细胞的神经视网膜组织中的神经节细胞、无长突细胞、水平细胞和/或双极细胞分化的方法，所述方法包括将包含神经视网膜祖细胞，且处于从神经节细胞刚出现后的分化阶段到视锥细胞前体细胞的出现率达到最大的分化阶段中的任一阶段的视网膜组织在包含甲状腺激素信号转导途径作用物质的培养基中培养的步骤。

Preparation of retinal tissue

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】视网膜组织的制备方法
本专利技术涉及双极细胞、无长突细胞、神经节细胞或水平细胞等的比例低，视细胞前体细胞或视细胞的比例高的适于移植的视网膜组织及它们的制备方法。
技术介绍
已知在视网膜色素变性等由于视细胞的变性、脱落引起的发生视力下降、视野缺损的疾病中，对于伴随变性、脱落的视细胞，最初接收来自视细胞的信号的双极细胞、除此以外的视网膜细胞在视细胞变性、脱落后也在一定时期中残存在视网膜组织内(非专利文献1)。因此，认为为了通过基于包含视细胞、视细胞前体细胞的视网膜组织的移植的再生医疗发挥治疗效果，优选源自所移植的视网膜组织的视细胞、视细胞前体细胞与接受移植的患者(接受者)的双极细胞进行接触，形成突触，即，形成视网膜神经通路(非专利文献2)。像这样，强烈需要开发来自患者的视网膜组织的双极细胞与来自被移植的视网膜组织的视细胞能够有效地形成突触的适于移植的视网膜组织及其制备方法。另一方面，有报告在使用从胎儿收集的视网膜细胞使其分化为视细胞前体细胞时，在将包含神经视网膜祖细胞的视网膜组织分散后，添加视黄酸、甲状腺激素之一的三碘甲状腺原氨酸(T3)而进行了贴壁培养(非专利文献3)。另外，有报告在将大鼠视网膜组织分散后，在视黄酸存在下进行贴壁培养的情况下，无长突细胞减少了(非专利文献4)。然而，尚不知晓甲状腺激素是否对双极细胞，神经节细胞，水平细胞等的分化造成影响。另外，也尚未已知从干细胞诱导的具有立体结构的视网膜组织中包含的无长突细胞，双极细胞，神经节细胞及水平细胞等细胞，调节这些细胞与视细胞前体细胞及视细胞的比例，制备适于移植的视网膜组织的方法。现有技术文献非专利文献非专利文献1：ProgRetinEyeRes，17(2)，175-205(1998)非专利文献2：ProcNatlAcadSciUSA，113(1)，E81-90(2016)非专利文献3：InvestOphthalmolVisSci，36(7)，1280-1289(1995)非专利文献4：Development120(8)，2091-2102(1994)
技术实现思路
专利技术要解决的问题本专利技术的课题为提供一种来自患者的视网膜组织的双极细胞与来自被移植的视网膜组织的视细胞能够有效地形成突触的适于移植的视网膜组织及其制备方法。解决问题的手段已知在视网膜色素变性等由于视细胞的变性、脱落引起的发生视力下降、视野缺损的疾病中，对于伴随变性、脱落的视细胞，最初接收来自视细胞的信号的双极细胞、除此以外的视网膜细胞在视细胞变性、脱落后也在一定时期中残存在视网膜组织内(非专利文献1)。因此，认为为了通过基于包含视细胞前体细胞的视网膜组织的移植的再生医疗发挥治疗效果，优选源自所移植的视网膜组织的视细胞与接受移植的患者(接受者)的双极细胞进行接触，经由上述视细胞前体细胞(或者视细胞)的突触末端而形成突触，即，形成视网膜神经通路(非专利文献2)。另外，已报告了移植的视网膜组织在其移植到的部位植活，取得特征性的莲座样结构，及视细胞前体细胞(或者视细胞)的基膜侧(即视细胞前体细胞，或视细胞的突触末端侧)与接受者的双极细胞接触能形成突触(非专利文献2)。在视网膜组织中，除了双极细胞的以外包含无长突细胞、神经节细胞，水平细胞，而这些细胞存在于视细胞前体细胞所存在的层(外核层)的神经视网膜组织的基膜侧。因此，在移植的视网膜组织取莲座样结构时，源自移植的视网膜组织的双极细胞，无长突细胞，神经节细胞及水平细胞成了位于源自移植的视网膜组织的视细胞前体细胞和接受者的双极细胞之间。因此，专利技术人认为，在源自移植的视网膜组织的视细胞将要与接受者的双极细胞接触时，源自移植的视网膜组织的双极细胞，无长突细胞，神经节细胞及水平细胞可构成空间、或物理上的障碍。另外，也存在以下可能性：在移植的神经视网膜组织内存在双极细胞时，在移植的神经视网膜组织内，视细胞会和双极细胞形成回路，不能实现源自移植的视网膜组织的视细胞与接受者的双极细胞有效地形成神经通路。根据这些认为，移植的神经视网膜组织内的双极细胞，无长突细胞，神经节细胞及水平细胞的比例越少，越优选。即，本专利技术人考虑通过降低用于移植的视网膜组织中这些不需要的细胞的比例，由此提高源自接受者的视网膜组织的双极细胞与来自被移植的视网膜组织的视细胞发生接触而形成突触的概率，并进行了深入研究。结果发现，将处于神经节细胞不出现或者刚出现后的分化阶段的包含神经视网膜祖细胞的视网膜组织在包含甲状腺激素信号转导途径作用物质的培养基中悬浮培养并使其成熟，由此降低视网膜组织中包含的对与生物体的移植部位的突触形成而言不需要的细胞，且提高视细胞前体细胞的比例，从而完成了本专利技术。另外，通过除了甲状腺激素信号转导途径作用物质以外，添加背侧化信号转导物质，由此进一步得到了神经视网膜中包含的全部细胞中视细胞前体细胞的比例，及视细胞前体细胞中的视锥细胞前体细胞的比例高的神经视网膜组织。即，本专利技术涉及以下内容：[1]一种抑制包含视细胞前体细胞和/或视细胞的神经视网膜组织中的神经节细胞、无长突细胞、水平细胞和/或双极细胞分化的方法，所述方法包括将包含神经视网膜祖细胞，且处于从神经节细胞刚出现后的分化阶段到视锥细胞前体细胞的出现率达到最大的分化阶段中的任一阶段的视网膜组织在包含甲状腺激素信号转导途径作用物质的培养基中培养的步骤。[2]根据上述[1]所述的方法，所述方法包括在包含甲状腺激素信号转导途径作用物质的培养基中培养到出现视杆细胞前体细胞和/或双极细胞的分化阶段。[3]根据上述[1]所述的方法，所述方法包括在包含甲状腺激素信号转导途径作用物质的培养基中培养到形成外丛状层的分化阶段。[4]根据上述[1]所述的方法，所述方法包括在包含甲状腺激素信号转导途径作用物质的培养基中培养到出现穆勒细胞的分化阶段。[5]根据上述[1]～[4]中任所述的抑制分化的方法，所述方法包括抑制PAX6阴性/CHX10强阳性细胞及PAX6阳性/CHX10阴性细胞的生成。[6]根据上述[1]～[5]中任一项所述的方法，其中，神经视网膜组织源自干细胞。[7]根据上述[6]所述的方法，其中，干细胞为多潜能干细胞。[8]根据上述[6]所述的方法，其中，干细胞为从发育成熟的视网膜得到的成体干细胞。[9]根据上述[1]～[8]中任一项所述的方法，其中，甲状腺激素信号转导途径作用物质为三碘甲状腺原氨酸。[10]根据上述[9]所述的方法，其中，三碘甲状腺原氨酸的浓度为1～100nM。[11]根据上述[1]～[10]中任一项所述的方法，其中，包含神经视网膜祖细胞，且处于神经节细胞刚出现后的分化阶段的视网膜组织，为相对于总细胞数而言神经视网膜祖细胞含有率为50％以上的视网膜组织。[12]根据上述[1]～[11]中任一项所述的方法，其中，培养方法为悬浮培养。[13]成熟的神经视网膜组织，或能成熟为成熟的神经视网膜组织的神经视网膜组织的制备方法，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.抑制包含视细胞前体细胞和/或视细胞的神经视网膜组织中的神经节细胞、无长突细胞、水平细胞和/或双极细胞分化的方法，所述方法包括将包含神经视网膜祖细胞，且处于从神经节细胞刚出现后的分化阶段到视锥细胞前体细胞的出现率达到最大的分化阶段中的任一阶段的视网膜组织在包含甲状腺激素信号转导途径作用物质的培养基中培养的步骤。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170914 JP 2017-1771881.抑制包含视细胞前体细胞和/或视细胞的神经视网膜组织中的神经节细胞、无长突细胞、水平细胞和/或双极细胞分化的方法，所述方法包括将包含神经视网膜祖细胞，且处于从神经节细胞刚出现后的分化阶段到视锥细胞前体细胞的出现率达到最大的分化阶段中的任一阶段的视网膜组织在包含甲状腺激素信号转导途径作用物质的培养基中培养的步骤。


2.根据权利要求1所述的方法，所述方法包括在包含甲状腺激素信号转导途径作用物质的培养基中培养到出现视杆细胞前体细胞和/或双极细胞的分化阶段。


3.根据权利要求1所述的方法，所述方法包括在包含甲状腺激素信号转导途径作用物质的培养基中培养到形成外丛状层的分化阶段。


4.根据权利要求1所述的方法，所述方法包括在包含甲状腺激素信号转导途径作用物质的培养基中培养到出现穆勒细胞的分化阶段。


5.根据权利要求1～4中任一项所述的抑制分化的方法，其中所述方法包括抑制PAX6阴性/CHX10强阳性细胞及PAX6阳性/CHX10阴性细胞的生成。


6.根据权利要求1～5中任一项所述的方法，其中，神经视网膜组织源自干细胞。


7.根据权利要求6所述的方法，其中，干细胞为多潜能干细胞。


8.根据权利要求6所述的方法，其中，干细胞为从发育成熟的视网膜得到的成体干细胞。


9.根据权利要求1～8中任一项所述的方法，其中，甲状腺激素信号转导途径作用物质为三碘甲状腺原氨酸。


10.根据权利要求9所述的方法，其中，三碘甲状腺原氨酸的浓度为1～100nM。


11.根据权利要求1～10中任一项所述的方法，其中，包含神经视网膜祖细胞，且处于神经节细胞刚出现后的分化阶段的视网膜组织，为相对于总细胞数而言神经视网膜祖细胞含有率为50％以上的视网膜组织。


12.根据权利要求1～11中任一项所述的方法，其中，培养方法为悬浮培养。


13.成熟的神经视网膜组织，或能成熟为成熟的神经视网膜组织的神经视网膜组织的制备方法，所述方法包括：
(1)将发育早期阶段的视网膜组织在培养基中培养，得到包含神经视网膜祖细胞，且处于从神经节细胞刚出现后的分化阶段到视锥细胞前体细胞的出现率达到最大的分化阶段中的任一阶段的视网膜组织的步骤；及
(2)将步骤(1)中得到的视网膜组织在包含甲状腺激素信号转导途径作用物质的培养基中培养的步骤。


14.根据权利要求13所述的制备方法，其中，步骤(1)中的培养基和/或步骤(2)中至少一部分的步骤中的培养基为包含抑制腹侧标记表达的程度的浓度的背侧化信号转导物质的培养基。


15.根据权利要求13或14所述的制备方法，其中，步骤(2)中的培养基包含抑制腹侧标记表达的程度的浓度的背侧化信号转导物质。


16.根据权利要求13～15中任一项所述的制备方法，其中，步骤(1)中的培养基包含抑制腹侧标记表达的程度的浓度的背侧化信号转导物质。


17.根据权利要求13～16中任一项所述的制备方法，其中，成熟的神经视网膜组织具有以下(i)～(iii)的特征：
(i)相对于总细胞数，视细胞前体细胞(photoreceptorprecursor)及视细胞(photoreceptor)的细胞数的比例为40％以上；
(ii)视细胞前体细胞及视细胞中包含的视锥细胞前体细胞(conephotoreceptorprecursor)及视锥细胞(conephotoreceptor)的含有率为70％以上；及
(iii)相对于总细胞数，双极细胞，神经节细胞，无长突细胞及水平细胞的细胞数的比例为30％以下。


18.根据权利要求13～16中任一项所述的制备方法，其中，能成熟为成熟的神经视网膜组织的神经视网膜组织具有以下(i)～(ii)的特征：
(i)相对于总细胞数，视细胞前体细胞及视细胞(CRX阳性细胞)的细胞数的比例为11％以上、优选为20％以上；及
(ii)相对于总细胞数，CRX阳性且TRβ2阳性细胞的细胞数的比例为7％以上、优选为10％以上；
其中，在确认到视锥细胞前体细胞的出现以后继续培养30～50天、优选为30～40天。


19.根据权利要求13～16中任一项所述的制备方法，其中，能成熟为成熟的神经视网膜组织的神经视网膜组织具有以下(i)～(ii)的特征：
(i)相对于总细胞数，视细胞前体细胞及视细胞(CRX阳性细胞)的比例为25％以上；及
(ii)视细胞前体细胞和/或视细胞(CRX阳性细胞)与顶端面相接，沿着与顶端面的切线垂直相交的直线至少并排存在2个细胞；
其中，在确认到视锥细胞前体细胞的出现以后继续培养55～80天、优选为55～70天。


20.根据权利要求13～17中任一项所述的制备方法，其中，
步骤(2)包括以下步骤(2-1)及(2-2)：
(2-1)将步骤(1)中得到的视网膜组织在包含甲状腺激素信号转导途径作用物质的培养基中，培养到确认到视锥细胞前体细胞的出现以后第30～80天的步骤；及，
(2-2)将步骤(2-1)中得到的视网膜组织在任选包含甲状腺激素信号转导途径作用物质的培养基中培养60～120天的步...

【专利技术属性】
技术研发人员：糠谷大树，永乐元次，木濑结子，大西晓士，高桥政代，笹井芳树，
申请(专利权)人：国立研究开发法人理化学研究所，大日本住友制药株式会社，住友化学株式会社，
类型：发明
国别省市：日本;JP