副粘病毒科表达系统技术方案

本发明专利技术是关于(载体)疫苗领域，且特别地是关于表达含有所关注外源性基因的副粘病毒科(Paramyxoviridae)病毒的核苷酸序列的增强布置。本发明专利技术另外是关于适于表达所关注基因，尤指抗原编码序列的相关表达盒及载体。本发明专利技术的该等病毒载体可用于产生免疫原性组合物或疫苗。

Expression system of Paramyxoviridae

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】副粘病毒科表达系统
本专利技术是关于(载体)疫苗领域，且特别地是关于用于通过含有所关注外源性基因的副粘病毒科(Paramyxoviridae)病毒来表达该外源性基因的核苷酸序列的增强布置。本专利技术另外是关于适于表达所关注基因，尤指抗原编码序列的相关表达盒及载体。本专利技术的该等病毒载体可用于产生免疫原性组合物或疫苗。
技术介绍
副粘病毒科的副粘病毒是造成许多流行动物及人类疾病的负义、单链、RNA病毒。副粘病毒的实例是感染家禽及其他禽类物种的新城疫病毒(Newcastlediseasevirus)或引起人类疾病的麻疹病毒。该等病毒当前包括49个物种且分成7个属，其中麻疹病毒(Morbillivirus)属具有7个物种。犬瘟热(CD)是狗及其他动物的高度感染性发热疾病。其死亡率较高，介于30％与80％之间。患有CD的狗通常具有永久性中枢神经系统损害。CD的确立病因是感染副粘病毒科的成员-麻疹病毒属(称为CD病毒(CDV))。一般而言，副粘病毒是含有18-20kb单链负极性RNA基因组的包膜病毒。该基因组编码5至7个结构蛋白，该等结构蛋白包含融合(F)及血凝素-神经胺酸酶(HN)或血凝素(H)糖蛋白。膜糖蛋白血凝素(H)负责将病毒附接至宿主细胞，且融合糖蛋白(F)引起病毒与感染细胞之间或感染细胞与相邻未感染细胞之间的膜融合。副粘病毒科成员的基因组末端由基因外区域(称为3′-前导体(leader)及5′-尾随体(trailer))组成：3′-前导体区域含有基因组启动子，且尾随体编码反基因组(其是全长正义复制中间体)的3′端且含有反基因组启动子。每一基因始于保守基因起始(GS)序列且止于保守基因末端(GE)序列。转录始于3′-前导体区域且以依序方式通过起止机制继续进行，个别基因通过该机制转录成个别、单独mRNA。通过非编码基因间序列(IGS)来分离基因，该等序列对于一些属(呼吸道病毒(Respirovirus)、麻疹病毒及亨尼病毒(Henipavirus))而言在不同基因接头处长度及序列保守且对于其他属(腮腺炎病毒(Rubulavirus)、禽腮腺炎病毒(Avulavirus)、肺炎病毒(Pneumovirus)及间质肺炎病毒(Metapneumovirus))而言序列或长度不保守。对于CDV而言，发现F及H糖蛋白存在于病毒包膜中及感染细胞表面上。通过自使用其他麻疹病毒成员的分析进行推断，CDVF及H糖蛋白似乎对于CDV感染及其免疫生物学较为重要且是必要的。已研发基于痘病毒的重组CDV疫苗来保护及治疗狗(US5,756,102)。美国专利申请案USSN09/587,964揭示基于DNA质粒的表达CDV抗原的疫苗。Wang等人(Vaccine30:5067–5072(2012))已通过使用反向基因学生成表达狂犬病毒糖蛋白的重组CDV疫苗菌株。然而，实践中可见的缺点在于，此一病毒菌株(可能通过重复非编码区序列之间的同源重组介导)可随时间失去插入基因。因此，强烈需要容许将外来遗传稳定插入副粘病毒科病毒基因组的表达系统。另外，犬瘟热病毒及犬细小病毒(CPV)是犬科动物及其他肉食性动物中具有全球分布的两种主要病原体。该两种病毒在肉食性动物群体中的流行病学及其成功控制高度取决于易感宿主的主动免疫化。接种疫苗方案最通常包括使用尤其含有减毒活犬细小病毒及犬瘟热病毒组分的多价疫苗。然而，成功免疫化取决于年龄类别、先前免疫状态及母源免疫性的存在。强烈需要寻找抵抗犬科动物的主要病原体(例如犬瘟热病毒及犬细小病毒)的改良疫苗。
技术实现思路
通过说明及申请专利范围中所描述的实施例来达成上述技术问题的解决方案。因此，根据申请专利范围来实施不同方面的专利技术。本专利技术是基于以下令人吃惊的发现，将包括在5′端侧接有CDV病毒中核蛋白(N)基因的5′非编码区的外来基因的表达盒插入CDV病毒基因组的磷蛋白(P)基因与基质蛋白(M)基因之间(参见图1)会产生容许即使在长时间段内亦容纳、维持及表达外来基因的病毒载体。此容许生成遗传稳定的基于转基因副粘病毒科的载体(例如基于CDV的载体)。在第一方面中，本专利技术由此提供用于插入副粘病毒科病毒的两个相邻必需基因(1；2)之间的表达盒，该插入使得第一基因(1)位于表达盒的3′方向上且第二基因(2)位于5′方向上，其中该表达盒包括-第一核苷酸序列，其中该第一核苷酸序列是所关注核苷酸序列，及-第二核苷酸序列，其侧接于第一核苷酸序列的5′端，其中该第二核苷酸序列是基因的5′非编码区，其中该基因是选自由副粘病毒科病毒中除第一基因(1)外的必需基因组成的群。本专利技术表达盒优选是RNA分子。优选地，该表达盒是经分离表达盒。本专利技术表达盒优选地进一步包括-第三核苷酸序列，其侧接于第一核苷酸序列的3′端，其中该第三核苷酸序列包括基因的3′非编码区或由其组成，其中该基因是选自由副粘病毒科病毒中除第二基因(2)外的必需基因组成的群。在一具体方面中，本专利技术使用CDV的莱德利(Lederle)疫苗菌株(以登录号VR-128寄存于ATCC)作为骨架(由基因库登录号DQ903854.1、AY288311或AY286480代表的基因型)或使用其至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的相同序列(例如来自通过其其他传代衍生的病毒(例如犬瘟热病毒，莱德利无毒，目录号NR-3845，BiodefenseandEmergingInfectionsResearchResourcesRepository,P.O.Box4137,Manassas,VA20108-4137,USA)。图2中的质粒图例示性展示用以生成本专利技术载体的DNA构建体。本专利技术载体尤其可用于对哺乳动物，尤指猪接种疫苗。本专利技术另外是关于用于针对CDV及另一病毒(尤其CDV及另一犬病毒(例如CPV))进行双重免疫化的载体。此双重免疫化载体表达来自载体骨架的CDV抗原及作为转基因插入的其他犬抗原(例如CPVVP2)。本专利技术由此还提供包括所关注异源性RNA序列的犬瘟热病毒(CDV)载体，该所关注异源性RNA序列优选地位于CDV的P基因与M基因之间，且其中该所关注异源性RNA序列编码犬细小病毒(CPV)VP2蛋白。另外，本专利技术涵盖用于在猪中诱导针对猪流感病毒或猪流行性腹泻病毒的免疫反应的载体。因此，在本专利技术的上下文中，还提供包括具有异源性RNA序列的表达盒的副粘病毒科病毒载体，该异源性RNA序列编码猪流感病毒的H3-亚型血凝素或猪流行性腹泻病毒的纤突蛋白(Spikeprotein)。本专利技术另外是关于包括该等载体的哺乳动物宿主细胞及使用该等宿主细胞生成载体疫苗的方法以及包括本专利技术的CDV载体的免疫原性组合物及疫苗。具体实施方式本专利技术解决了先前技术中的固有问题且提供最新技术的显著进步。本专利技术通过活体外数据展示根据本文提供的示例内容所产生编码2b或2cCPV基因型VP2蛋白的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种表达盒，其用于插入副粘病毒科(Paramyxoviridae)病毒的两个相邻必需基因(1；2)之间，从而所述第一基因(1)位于所述表达盒的3′方向上，且所述第二基因(2)位于5′方向上，其中所述表达盒包括：/n-第一核苷酸序列，其中所述第一核苷酸序列是所关注的异源性或外源性核苷酸序列，及/n-第二核苷酸序列，其侧接于所述第一核苷酸序列的5′端，其中所述第二核苷酸序列是基因的5′非编码区，其中所述基因是选自由副粘病毒科病毒中除所述第一基因(1)外的其他必需基因组成的群，及/n-第三核苷酸序列，其侧接于所述第一核苷酸序列的3′端，其中所述第三核苷酸序列包括基因的3′非编码区或由其组成，其中所述基因是选自由副粘病毒科病毒中除所述第二基因(2)外的其他必需基因组成的群。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170923 EP 17192791.61.一种表达盒，其用于插入副粘病毒科(Paramyxoviridae)病毒的两个相邻必需基因(1；2)之间，从而所述第一基因(1)位于所述表达盒的3′方向上，且所述第二基因(2)位于5′方向上，其中所述表达盒包括：
-第一核苷酸序列，其中所述第一核苷酸序列是所关注的异源性或外源性核苷酸序列，及
-第二核苷酸序列，其侧接于所述第一核苷酸序列的5′端，其中所述第二核苷酸序列是基因的5′非编码区，其中所述基因是选自由副粘病毒科病毒中除所述第一基因(1)外的其他必需基因组成的群，及
-第三核苷酸序列，其侧接于所述第一核苷酸序列的3′端，其中所述第三核苷酸序列包括基因的3′非编码区或由其组成，其中所述基因是选自由副粘病毒科病毒中除所述第二基因(2)外的其他必需基因组成的群。


2.如权利要求1的表达盒，其中所述表达盒由以下组成：
-所述第一核苷酸序列，及
-所述第二核苷酸序列，及
-所述第三核苷酸序列，及
-另一核苷酸序列，其侧接于所述第二核苷酸序列的5′端或侧接于所述第三核苷酸序列的3′端，其中所述另一核苷酸序列是副粘病毒科病毒的基因间序列。


3.如权利要求1或2的表达盒，其中所述第三核苷酸序列由以下组成：
-选自由副粘病毒科病毒中除所述第二基因(2)外的其他必需基因组成的群的基因的所述3′非编码区，和
-侧接于所述3′非编码区的5′端的序列，其中侧接于所述3′非编码区的所述5′端的所述序列编码用于开始或增强翻译的共有序列，且其中所述用于开始或增强翻译的共有序列视情况是Kozak序列。


4.如权利要求1至3中任一项的表达盒，其用于插入副粘病毒科病毒的P基因与M基因之间，其中
-所述由副粘病毒科病毒中除所述第一基因(1)外的其他必需基因组成的群是由副粘病毒科病毒中除副粘病毒科病毒的所述P基因外的其他必需基因组成的群，且其中所述基因视情况选自由副粘病毒科病毒的N、M、F、H及L基因组成的群，且
-所述由副粘病毒科病毒中除所述第二基因(2)外的其他必需基因组成的群是由副粘病毒科病毒中除副粘病毒科病毒的所述M基因外的其他必需基因组成的群，且其中所述基因视情况选自由副粘病毒科病毒的H、P、F、L及N基因组成的群。


5.如权利要求1至4中任一项的表达盒，其中所述核苷酸序列是RNA序列，和/或
其中所述第一核苷酸序列可操作地连接至所述第三核苷酸序列中所包含的基因起始(GS)序列和/或副粘病毒科病毒的基因组启动子。


6.副粘病毒科病毒载体，包括如权利要求1至5中任一项的表达盒。


7.如权利要求1至5中任一项的表达盒，或如权利要求6的副粘病毒科病毒载体，其中
-所述5′非编码区是副粘病毒科病毒的N基因的5′非编码区，和/或
-所述3′非编码区是副粘病毒科病毒的H基因的3′非编码区，和/或
其中所述表达盒插入副粘病毒科病毒的P基因与M基因之间。


8.如前述任一项权利要求的表达盒或副粘病毒科病毒载体，其中所述副粘病毒科病毒是CDV，且其中CDV基因的所述5′非编码区是选自由以下组成的群：
CDV的N基因的5′非编码区，其中CDV的N基因的所述5′非编码区优选地由与SEQIDNO:1的序列至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的RNA序列组成或包括所述序列，
CDV的P基因的5′非编码区，其中CDV的P基因的所述5′非编码区优选地由与SEQIDNO:2的序列至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的RNA序列组成或包括所述序列，
CDV的M基因的5′非编码区，其中CDV的M基因的所述5′非编码区优选地由与SEQIDNO:3的序列至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的RNA序列组成或包括所述序列，
CDV的F基因的5′非编码区，其中CDV的F基因的所述5′非编码区优选地由与SEQIDNO:4的序列至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的RNA序列组成或包括所述序列，
CDV的H基因的5′非编码区，其中CDV的H基因的所述5′非编码区优选地由与SEQIDNO:5的序列至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的RNA序列组成或包括所述序列，及
CDV的L基因的5′非编码区，其中CDV的L基因的所述5′非编码区优选地由与SEQIDNO:6的序列至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的RNA序列组成或包括所述序列。


9.如前述任一项权利要求的表达盒或副粘病毒科病毒载体，其中所述副粘病毒科病毒是CDV，且其中CDV基因的所述3′非编码区是选自由以下组成的群：
CDV的H基因的3′非编码区，其中CDV的H基因的所述3′非编码区优选地由与SEQIDNO:7的序列至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的RNA序列组成或包括所述序列，
CDV的N基因的3′非编码区，其中CDV的N基因的所述3′非编码区优选地由与SEQIDNO:8的序列至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的RNA序列组成或包括所述序列，
CDV的P基因的3′非编码区，其中CDV的P基因的所述3′非编码区优选地由与SEQIDNO:9的序列至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的RNA序列组成或包括所述序列，
CDV的M基因的3′非编码区，其中CDV的M基因的所述3′非编码区优选地由与SEQIDNO:10的序列至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的RNA序列组成或包括所述序列，
CDV的F基因的3′非编码区，其中CDV的F基因的所述3′非编码区优选地由与SEQIDNO:11的序列至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的RNA序列组成或包括所述序列，及
CDV的L基因的3′非编码区，其中CDV的L基因的所述3′非编码区优选地由与SEQIDNO:12的序列至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的RNA序列组成或包括所述序列。


10.如前述任一项权利要求的表达盒或副粘病毒科病毒载体，其中所述第二核苷酸序列是CDV的N基因的5′非编码区，且其中CDV的N基因的所述5′非编码区优选地由与SEQIDNO:1的序列至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的RNA序列组成或包括所述序列。


11.如前述任一项权利要求的表达盒或副粘病毒科病毒载体，其中
-选自由副粘病毒科病毒中除所...

【专利技术属性】
技术研发人员：V·尼科林，A·本特，A·加列，
申请(专利权)人：勃林格殷格翰动物保健有限公司，
类型：发明
国别省市：德国;DE