【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于条件调控基因表达的方法和系统相关申请的交叉引用本申请要求于2017年7月12日提交的美国临时申请号62/531,752和于2017年11月17日提交的美国临时申请号62/587,668的权益，其全部内容通过引用整体并入本文。
技术介绍
受体是一种蛋白质分子，可以从细胞外部接收生化信号。在一些情况下，受体直接或间接与细胞生化途径相连接，并且配体与受体的结合(例如，生化信号)可以激活或抑制受体的相关生化途径。细胞受体与配体的相互作用可在感知环境因素并将细胞外刺激转化为细胞内信号传导中发挥核心作用。细胞内信号传导可导致生化过程的调控，包括基因表达的转录激活和控制细胞行为的新蛋白质合成。具有可被环境因素条件控制的特征的工程化细胞可用于调控细胞反应以及用于基因和细胞疗法应用。条件基因表达系统允许条件调控一个或多个靶基因。条件基因表达系统如药物可诱导的基因表达系统允许响应于刺激(诸如药物的存在)而使基因表达激活和/或失活。然而，由于控制不精确、诱导(例如，基因表达的激活和/或失活)水平不足以及缺乏特异性，当前可用的系统可能受到限制。
【技术保护点】
1.一种用于调控第一靶基因在细胞中的表达的系统，包含：/n第一跨膜受体，其包含第一配体结合域和第一信号传导域，其中在第一配体与所述第一配体结合域结合后，所述第一信号传导域激活所述细胞的第一信号传导途径；以及/n第一表达盒，其包含置于第一启动子的控制下的编码第一基因调节多肽(GMP)的核酸序列，其中所述第一GMP包含第一致动部分，并且其中在所述第一配体与所述第一配体结合域结合后，所述第一启动子被激活以驱动所述第一GMP的表达，/n其中所述表达的第一GMP调控所述第一靶基因的表达。/n
【技术特征摘要】 【专利技术属性】
【国外来华专利技术】20170712 US 62/531,752;20171117 US 62/587,6681.一种用于调控第一靶基因在细胞中的表达的系统，包含：
第一跨膜受体，其包含第一配体结合域和第一信号传导域，其中在第一配体与所述第一配体结合域结合后，所述第一信号传导域激活所述细胞的第一信号传导途径；以及
第一表达盒，其包含置于第一启动子的控制下的编码第一基因调节多肽(GMP)的核酸序列，其中所述第一GMP包含第一致动部分，并且其中在所述第一配体与所述第一配体结合域结合后，所述第一启动子被激活以驱动所述第一GMP的表达，
其中所述表达的第一GMP调控所述第一靶基因的表达。
2.根据权利要求1所述的系统，进一步包含第二跨膜受体，所述第二跨膜受体包含第二配体结合域和第二信号传导域，其中在第二配体与所述第二配体结合域结合后，所述第二信号传导域激活所述细胞的第二信号传导途径。
3.根据权利要求2所述的系统，其中在(i)所述第一配体与所述第一配体结合域结合后，并且/或者(ii)所述第二配体与所述第二配体结合域结合后，所述第一启动子被激活以驱动所述第一GMP的表达。
4.根据权利要求2所述的系统，进一步包含第二表达盒，所述第二表达盒包含置于第二启动子的控制下的编码第二基因调节多肽(GMP)的核酸序列，其中所述第二GMP包含第二致动部分，并且其中在所述第二配体与所述第二配体结合域结合后，所述第二启动子被激活以驱动所述第二致动部分的表达。
5.根据权利要求4所述的系统，其中所述第二GMP调控第二靶基因在所述细胞中的表达。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的系统，其中(i)所述第一启动子包括第一内源启动子，其在所述第一配体与所述第一配体结合域结合后被激活，并且/或者(ii)所述第二启动子包括第二内源启动子，其在所述第二配体与所述第二配体结合域结合后被激活。
7.根据权利要求6所述的系统，其中(i)编码所述第一GMP的核酸序列与所述第一内源启动子可操作地连接，并且/或者(ii)编码所述第二GMP的核酸序列与所述第二内源启动子可操作地连接。
8.根据权利要求6所述的系统，其中(i)所述第一表达盒包含编码第一内源蛋白质的第一基因，其中所述第一基因位于编码所述第一GMP的核酸序列的上游，并且其中所述第一内源蛋白质的表达由所述第一内源启动子驱动，并且/或者(ii)所述第二表达盒包含编码第二内源蛋白质的第二基因，其中所述第二基因位于编码所述第二GMP的核酸序列的上游，并且其中所述第二内源蛋白质的表达由所述第二内源启动子驱动。
9.根据权利要求8所述的系统，其中(i)所述第一基因和编码所述第一GMP的核酸序列通过编码第一肽接头的核酸序列连接，并且/或者(ii)所述第二基因和编码所述第二GMP的核酸序列通过编码第二肽接头的核酸序列连接。
10.根据权利要求9所述的系统，其中所述第一肽接头和/或所述第二肽接头包含蛋白酶识别序列。
11.根据权利要求9所述的系统，其中所述第一肽接头和/或所述第二肽接头包含自切割区段。
12.根据权利要求11所述的系统，其中所述自切割区段包括2A肽。
13.根据权利要求12所述的系统，其中所述2A肽是T2A、P2A、E2A或F2A。
14.根据权利要求8所述的系统，其中(i)所述第一基因和编码所述第一GMP的核酸序列通过包含第一内部核糖体进入位点(IRES)的核酸序列连接，并且/或者(ii)所述第二基因和编码所述第二GMP的核酸序列通过包含第二IRES的核酸序列连接。
15.根据权利要求1-5中任一项所述的系统，其中(i)所述第一启动子包括第一外源启动子，其在所述第一配体与所述第一配体结合域结合后被激活，并且/或者(ii)所述第二启动子包括第二外源启动子，其在所述第二配体与所述第二配体结合域结合后被激活。
16.根据权利要求15所述的系统，其中(i)所述第一外源启动子包括合成启动子序列，并且/或者(ii)所述第二外源启动子包括合成启动子序列。
17.根据权利要求15所述的系统，其中(i)编码所述第一GMP的核酸序列与所述第一外源启动子可操作地连接，并且/或者(ii)编码所述第二GMP的核酸序列与所述第二外源启动子可操作地连接。
18.根据权利要求1-17中任一项所述的系统，其中(i)所述第一跨膜受体包括内源受体，并且/或者(ii)所述第二跨膜受体包括内源受体。
19.根据权利要求1-17中任一项所述的系统，其中(i)所述第一跨膜受体包括合成受体，并且/或者(ii)所述第二跨膜受体包括合成受体。
20.根据权利要求1-17中任一项所述的系统，其中(i)所述第一跨膜受体包括嵌合抗原受体(CAR)、T细胞受体(TCR)、G蛋白偶联受体(GPCR)、整联蛋白受体或Notch受体，并且/或者(ii)所述第二跨膜受体包括嵌合抗原受体(CAR)、T细胞受体(TCR)、G蛋白偶联受体(GPCR)、整联蛋白受体或Notch受体。
21.根据权利要求20所述的系统，其中(i)所述第一跨膜受体包括GPCR，并且/或者(ii)所述第二跨膜受体包括GPCR。
22.根据权利要求20所述的系统，其中(i)所述第一跨膜受体包括嵌合抗原受体(CAR)，并且/或者(ii)所述第二跨膜受体包括嵌合抗原受体(CAR)。
23.根据权利要求22所述的系统，其中所述CAR的所述配体结合域包括Fab、单链Fv(scFv)、细胞外受体域和Fc结合域中的至少一种。
24.根据权利要求22或23所述的系统，其中所述CAR的所述信号传导域包括基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)。
25.根据权利要求22或23所述的系统，其中所述CAR的所述信号传导域包括基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)。
26.根据权利要求22-25中任一项所述的系统，其中所述CAR的所述信号传导域包括共刺激域。
27.根据前述权利要求中任一项所述的系统，其中所述第一GMP的所述致动部分和/或所述第二GMP的所述致动是RNA指导的致动部分，并且其中所述系统进一步包含与所述RNA指导的致动部分复合的指导RNA。
28.根据权利要求27所述的系统，其中所述RNA指导的致动部分是Cas9。
29.根据权利要求28所述的系统，其中Cas9是酿脓链球菌Cas9。
30.根据权利要求28所述的系统，其中Cas9是金黄色葡萄球菌Cas9。
31.根据权利要求28-30中任一项所述的系统，其中Cas9实质上缺乏核酸酶活性。
32.根据权利要求27所述的系统，其中所述RNA指导的致动部分是Cpf1。
33.根据权利要求32所述的系统，其中Cpf1实质上缺乏核酸酶活性。
34.根据前述权利要求中任一项所述的系统，其中所述第一GMP和/或所述第二GMP包括核定位序列(NLS)。
35.根据前述权利要求中任一项所述的系统，其中所述第一GMP和/或所述第二GMP包括转录激活因子或阻遏因子。
36.根据前述权利要求中任一项所述的系统，其中所述第一启动子和/或所述第二启动子选自IL-2、IFN-γ、IRF4、NR4A1、PRDM1、TBX21、CD69、CD25和GZMB启动子。
37.根据前述权利要求中任一项所述的系统，其中所述第一靶基因和/或第二靶基因编码细胞因子、T细胞受体(TCR)或免疫检查点抑制剂。
38.根据权利要求37所述的系统，其中所述第一靶基因和/或所述第二靶基因编码免疫检查点抑制剂。
39.根据权利要求38所述的系统，其中所述免疫检查点抑制剂是PD-1、CTLA-4、LAG3、TIM-3、A2AR、B7-H3、B7-H4、BTLA、IDO、KIR或VISTA。
40.根据前述权利要求中任一项所述的系统，其中所述细胞是免疫细胞、造血祖细胞或造血干细胞。
41.根据权利要求40所述的系统，其中所述细胞是免疫细胞。
42.根据权利要求41所述的系统，其中所述免疫细胞是淋巴细胞。
43.根据权利要求42所述的系统，其中所述淋巴细胞是T细胞。
44.根据权利要求42所述的系统，其中所述淋巴细胞是自然杀伤(NK)细胞。
45.一种用于调控靶基因在细胞中的表达的系统，包含：
第一跨膜受体，其包含第一配体结合域和第一信号传导域，其中在第一配体与所述第一配体结合域结合后，所述第一信号传导域激活所述细胞的第一信号传导途径；
第二跨膜受体，其包含第二配体结合域和第二信号传导域，其中在第二配体与所述第二配体结合域结合后，所述第二信号传导域激活所述细胞的第二信号传导途径；
第一表达盒，其包含置于第一启动子的控制下的编码第一局部基因调节多肽(GMP)的核酸序列，其中所述第一局部GMP包含致动部分的第一部分，并且其中在所述第一配体与所述第一配体结合域结合后，所述第一启动子被激活以驱动所述第一局部GMP的表达；以及
第二表达盒，其包含置于第二启动子的控制下的编码第二局部基因调节多肽(GMP)的核酸序列，其中所述第二局部GMP包含致动部分的第二部分，并且其中在所述第二配体与所述第二配体结合域结合后，所述第二启动子被激活以驱动所述第二局部GMP的表达；
其中所述致动部分的所述第一部分和所述第二部分复合以形成包含功能性致动部分的重构的GMP，其中所述重构的GMP调控所述靶基因的表达。
46.根据权利要求45所述的系统，其中所述功能性致动部分包括RNA指导的致动部分，并且其中所述系统进一步包含与所述RNA指导的致动部分复合的指导RNA。
47.根据权利要求46所述的系统，其中所述RNA指导的致动部分是Cas9。
48.根据权利要求47所述的系统，其中Cas9是酿脓链球菌Cas9。
49.根据权利要求47所述的系统，其中Cas9是金黄色葡萄球菌Cas9。
50.根据权利要求47-49中任一项所述的系统，其中Cas9实质上缺乏核酸酶活性。
51.根据权利要求46所述的系统，其中所述RNA指导的致动部分是Cpf1。
52.根据权利要求51所述的系统，其中Cpf1实质上缺乏核酸酶活性。
53.根据权利要求45-52中任一项所述的系统，其中所述第一局部GMP和所述第二局部GMP中的至少一个包含核定位序列(NLS)。
54.一种诱导基因调节多肽(GMP)的表达的方法，包括：
(a)提供表达具有配体结合域和信号传导域的跨膜受体的细胞；
(b)使配体与所述跨膜受体的所述配体结合域结合，其中所述结合激活所述细胞的信号传导途径，使得与编码所述GMP的核酸序列可操作地连接的启动子被随之激活；以及
(c)在所述启动子激活后表达所述GMP。
55.一种调控靶基因在细胞中的表达的方法，包括：
使配体与包含配体结合域和信号传导域的跨膜受体接触，其中在所述接触后，所述信号传导域激活所述细胞的信号传导途径；
从表达构建体表达包含致动部分的基因调节多肽(GMP)，所述表达构建体包含置于启动子控制下的编码所述GMP的核酸序列，其中在所述配体与所述配体结合域结合后，所述启动子被激活以驱动所述GMP的表达；以及
通过所述表达的GMP的结合增加或减少所述靶基因的表达，从而调控所述靶基因的表达。
56.根据权利要求54或55所述的方法，其中所述跨膜受体包括内源受体。
57.根据权利要求54或55所述的方法，其中所述跨膜受体包括合成受体。
58.根据权利要求54或55所述的方法，其中所述跨膜受体包括嵌合抗原受体(CAR)、T细胞受体(TCR)、G蛋白偶联受体(GPCR)、整联蛋白受体或Notch受体。
59.根据权利要求58所述的方法，其中所述跨膜受体包括GPCR。
60.根据权利要求58所述的方法，其中所述跨膜受体包括嵌合抗原受体(CAR)。
61.根据权利要求60所述的方法，其中所述CAR的所述配体结合域包括Fab、单链Fv(scFv)、细胞外受体域和Fc结合域中的至少一种。
62.根据权利要求60或61所述的方法，其中所述CAR的所述信号传导域包括基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)。
63.根据权利要求60或61所述的方法，其中所述CAR的所述信号传导域包括基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)。
64.根据权利要求60-63中任一项所述的方法，其中所述CAR的所述信号传导域包括共刺激域。
65.根据权利要求54-64中任一项所述的方法，其中所述致动部分是RNA指导的致动部分。
66.根据权利要求65所述的方法，其中所述RNA指导的致动部分是Cas9。
67.根据权利要求66所述的方法，其中Cas9是酿脓链球菌Cas9。
68.根据权利要求66所述的方法，其中Cas9是金黄色葡萄球菌Cas9。
69.根据权利要求66-68中任一项所述的方法，其中Cas9实质上缺乏核酸酶活性。
70.根据权利要求65所述的方法，其中所述RNA指导的致动部分是Cpf1。
71.根据权利要求70所述的方法，其中Cpf1实质上缺乏核酸酶活性。
72.根据权利要求54-71中任一项所述的方法，其中所述GMP包括核定位序列(NLS)。
73.根据权利要求54-72中任一项所述的方法，其中所述GMP包括转录激活因子或阻遏因子。
74.根据权利要求54-73中任一项所述的方法，其中所述细胞是免疫细胞、造血祖细胞或造血干细胞。
75.根据权利要求74所述的方法，其中所述细胞是免疫细胞。
76.根据权利要求75所述的方法，其中所述免疫细胞是淋巴细胞。
77.根据权利要求76所述的方法，其中所述淋巴细胞是T细胞。
78.根据权利要求76所述的方法，其中所述淋巴细胞是自然杀伤(NK)细胞。
79.一种表达盒，其包含与编码包含致动部分的基因调节多肽(GMP)的核酸序列可操作地连接的启动子，其中所述表达盒的特征在于，当所述表达盒存在于表达已通过配体与所述跨膜受体结合而被激活的跨膜受体的细胞中时，所述启动子被激活以驱动从所述表达盒表达所述GMP。
80.根据权利要求79所述的表达盒，其中跨膜受体包含信号传导域，并且其中当所述跨膜受体被激活时，所述信号传导域激活所述细胞的信号传导途径。
81.根据权利要求80所述的表达盒，其中所述跨膜受体的所述信号传导域激活免疫细胞信号传导途径。
82.根据权利要求80所述的表达盒，其中所述细胞的所述激活的信号传导途径的转录因子与所述启动子结合，从而激活所述启动子以驱动从所述表达盒表达所述GMP。
83.根据权利要求79所述的表达盒，其中所述启动子包含内源启动子序列。
84.根据权利要求79所述的表达盒，其中所述启动子包含合成启动子序列。
85.根据权利要求79所述的表达盒，其中所述致动部分是RNA指导的致动部分。
86.根据权利要求85所述的表达盒，其中所述RNA指导的致动部分是Cas9。
87.根据权利要求86所述的表达盒，其中Cas9是酿脓链球菌Cas9。
88.根据权利要求86所述的表达盒，其中Cas9是金黄色葡萄球菌Cas9。
89.根据权利要求86-88中任一项所述的表达盒，其中Cas9实质上缺乏核酸酶活性。
90.根据权利要求85所述的表达盒，其中所述RNA指导的致动部分是Cas9。
91.根据权利要求90所述的表达盒，其中Cpf1实质上缺乏核酸酶活性。
92.根据权利要求79-91中任一项所述的表达盒，其中所述启动子是IL-2、IFN-γ、IRF4、NR4A1、PRDM1、TBX21、CD69、CD25或GZMB启动子。
93.根据权利要求79-92中任一项所述的表达盒，其中所述GMP包括核定位序列(NLS)。
94.根据权利要求79-93中任一项所述的表达盒，其中所述GMP包括转录激活因子或转录阻遏因子。
95.根据权利要求79-94所述的表达盒，其中所述表达盒被整合到所述细胞基因组中。
96.根据权利要求95所述的表达盒，其中所述表达盒通过慢病毒被整合到所述细胞基因组中。
97.根据权利要求95所述的表达盒，其中所述表达盒在包含安全港位点的区域处整合到所述细胞基因组中。
98.根据权利要求95所述的表达盒，其中所述表达盒被整合到19号染色体的AAVS1位点中。
99.根据权利要求95所述的表达盒，其中所述表达盒被整合到3号染色体的CCR5位点中。
100.根据权利要求95所述的表达盒，其中所述表达盒通过可编程核酸酶被整合到所述细胞基因组中。
101.根据权利要求100所述的表达盒，其中所述可编程核酸酶是RNA指导的核酸酶、锌指核酸酶(ZNF)或转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)。
102.一种表达盒，其包含(i)编码基因调节多肽(GMP)的核酸序列，和(ii)促进所述表达盒整合到细胞基因组中的至少一个整合序列，其中所述GMP包含致动部分，并且其中所述表达盒的特征在于，当所述表达盒已经通过所述至少一个整合序列整合到所述细胞基因组中时，通过配体与跨膜受体结合来激活所述跨膜受体，从而激活启动子以驱动从所述表达盒表达所述GMP。
103.根据权利要求102所述的表达盒，其中所述至少一个整合序列促进所述表达盒整合到所述细胞基因组的区域中，使得编码所述GMP的核酸序列与内源启动子可操作地连接。
104.根据权利要求103所述的表达盒，其中所述至少一个整合序列促进所述表达盒整合到所述细胞基因组的区域中，使得编码所述GMP的核酸序列(i)与内源启动子可操作地连接，和(ii)位于编码内源蛋白质的基因的下游，其中所述内源蛋白质在所述细胞中的表达由所述内源启动子驱动。
105.根据权利要求104所述的表达盒，其中编码所述GMP的核酸序列通过编码肽接头的核酸序列与所述基因连接。
106.根据权利要求105所述的表达盒，其中编码所述GMP的核酸序列与所述基因框内连接。
107.根据权利要求105所述的表达盒，其中所述肽接头包含蛋白酶识别序列。
108.根据权利要求105所述的表达盒，其中所述肽接头包含自切割区段。
109.根据权利要求108所述的表达盒，其中所述自切割片段包括2A肽。
110.根据权利要求109所述的表达盒，其中所述2A肽是T2A、P2A、E2A或F2A。
111.根据权利要求104所述的表达盒，其中编码所述GMP的核酸序列通过包含内部核糖体进入位点(IRES)的核酸序列与所述基因连接。
112.根据权利要求102-111中任一项所述的表达盒，其中所述至少一个整合序列包含同源序列，并且其中所述表达盒通过同源介导修复(HDR)整合到所述细胞基因组中。
113.根据权利要求112所述的表达盒，其中两个整合序列位于编码基因调节多肽(GMP)的所述核酸序列的侧翼，所述两个整合序列各自包含同源序列。
114.根据权利要求112或113所述的表达盒，其中所述同源序列促进所述表达盒整合到所述细胞基因组的靶区域中。
115.根据权利要求102-114中任一项所述的表达盒，其中在所述表达盒整合之后，编码基因调节多肽的所述核酸序列位于所述启动子的下游。
116.一种细胞，其包含根据权利要求1-53中任一项所述的系统。
技术研发人员：汪建斌，王秉中，刘佩琪，
申请(专利权)人：瑞非生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：美国;US
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