大肠杆菌发酵培养基及发酵培养方法技术

本发明专利技术提供一种大肠杆菌发酵培养基及发酵培养方法。所述发酵培养基包括组分：酵母提取物10‑12g/L、磷酸氢二钠3‑4g/L、磷酸二氢钾11.5‑13.5g/L、硫酸铵1.5‑2.5g/L、氯化铵0.5‑1.0g/L、柠檬酸钠1.0‑2.0g/L、葡萄糖10‑12g/L和七水硫酸镁1.0‑1.5g/L。本发明专利技术仅采用酵母提取物作为大肠杆菌发酵培养过程中的主要氮源，通过对发酵培养过程中的各种参数优化控制，获得目的蛋白的高效表达，可收获大量的生物产物。利用本发明专利技术提供的大肠杆菌发酵培养基，培养得到的生物湿菌产量不低于常规培养基，经过发酵过程的优化，生物湿菌产量可由20g/L提高至30g/L。

Fermentation medium and culture method of Escherichia coli

【技术实现步骤摘要】
大肠杆菌发酵培养基及发酵培养方法
本专利技术涉及大肠杆菌发酵领域，具体地说，涉及一种大肠杆菌发酵培养基及发酵培养方法。
技术介绍
目前，常规的大肠杆菌发酵培养用培养基营养成分中均含有蛋白胨及酵母提取物。由于动物源蛋白胨引入的外源因子对人用产品可能带来风险。因此，在利用大肠杆菌制备的药物申报中限制使用动物源的蛋白胨，而采用植物源的蛋白胨进行发酵培养后，降低了目的蛋白产量并且增加了生产成本。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种不添加动物源和植物源成分的大肠杆菌发酵培养基。本专利技术的另一目的是提供上述培养基发酵培养大肠杆菌的方法。为了实现本专利技术目的，第一方面，本专利技术提供一种大肠杆菌发酵培养基，包括如下组分：酵母提取物10-12g/L、磷酸氢二钠3-4g/L、磷酸二氢钾11.5-13.5g/L、硫酸铵1.5-2.5g/L、氯化铵0.5-1.0g/L、柠檬酸钠1.0-2.0g/L、葡萄糖10-12g/L和七水硫酸镁1.0-1.5g/L。优选地，所述大肠杆菌发酵培养基包括如下组分：酵母提取物10g/L、磷酸氢二钠4g/L、磷酸二氢钾13.5g/L、硫酸铵2.5g/L、氯化铵0.5g/L、柠檬酸钠2.0g/L、葡萄糖10g/L和七水硫酸镁1.0g/L。第二方面，本专利技术提供所述培养基在大肠杆菌发酵生产中的应用。第三方面，本专利技术提供一种大肠杆菌发酵培养方法，包括以下步骤：1)一级种子制备；2)二级种子制备；3)将二级种子接入所述发酵培养基中，进行发酵培养。本专利技术中，所述大肠杆菌可以是利用基因工程手段改造得到的工程菌，例如，表达重组结核杆菌变态反应原(结核分枝杆菌重组融合蛋白EECC)的重组大肠杆菌pET28a-EECC/BL21(DE3)，其构建方法可参见CN110423279A。前述的方法，步骤1)包括：取200ul甘油管中保存的菌液加入装有200ml基础培养基的三角瓶中，37℃、200rpm振荡培养8-10小时，得到一级种子。其中，所述基础培养基的配方为：酵母提取物10-12g/L、磷酸氢二钠3-4g/L、磷酸二氢钾11.5-13.5g/L、硫酸铵1.5-2.5g/L、氯化铵0.5-1.0g/L、柠檬酸钠1.0-2.0g/L和卡那霉素50mg/L。步骤2)包括：按1‰v/v的比例将一级种子接种至装有200ml基础培养基的三角瓶中，37℃、200rpm振荡培养14-16小时，得到二级种子。步骤3)包括：按10％v/v的比例将二级种子转接至装有发酵培养基的发酵罐中，装液量2.5L/5L，在29.5℃-37℃、通气量2-4NL/min，溶氧30％，转速200-600rpm的条件下进行发酵培养，发酵过程中，将发酵体系的pH值控制在7.0；待菌液OD600值为8-12，加入IPTG至终浓度为0.2mM，诱导4-6小时后，结束发酵，离心收获菌体。进一步地，步骤3)还包括补料操作，具体如下：按10％v/v的比例将二级种子转接至装有发酵培养基的发酵罐中，装液量2.5L/5L，在29.5℃-37℃、通气量2-4NL/min，溶氧30％，转速200-600rpm的条件下进行发酵培养，发酵过程中，将发酵体系的pH值控制在7.0；待菌液OD600值大于1.0按如下方式进行补料：第一次补料采用定时补料方式，向发酵罐中加入补料培养基①，补料量2％-3.6％/L，每小时补加60-85mL，当菌液OD600值大于6.0停止补加补料培养基①，开始第二次补料；第二次补料采用定量补料的方式，向发酵罐中加入补料培养基②，补料量每小时50mL，当菌液OD600值为8-12，进入诱导期；加入IPTG至终浓度为0.2mM，诱导4-6小时后，结束发酵，离心收获菌体；进入诱导期后开始第三次补料，同时加入补料培养基①和补料培养基②，补料培养基①每小时补料3.6％/L，补料培养基②每小时补料50mL，直至发酵结束。所述补料培养基①为：葡萄糖400-500g/L、硫酸镁10-12g/L和微量元素溶液2mL/L；所述微量元素溶液的配方为：三氯化铁27g/L、六水合氯化钴2g/L、钼酸钠2g/L、氯化钙24.6g/L、无水硫酸铜1g/L、硼酸0.5g/L、三氯化铝10g/L和盐酸100mL/L，其中，盐酸的浓度为36％-38％。所述补料培养基②为：240g/L酵母提取物溶液。在本专利技术的一个具体实施方式中，步骤3)的发酵过程见表1。表1其中，补料(1)的成分为：葡萄糖500g/L、硫酸镁10g/L和微量元素溶液2ml/L；定时补料，补料量2％-3.6％/L，每小时补加60-85mL。补料(2)的成分为：240g/L酵母提取物溶液。定量补料，每小时补料量50mL。借由上述技术方案，本专利技术至少具有下列优点及有益效果：本专利技术仅采用酵母提取物作为大肠杆菌发酵培养过程中的主要氮源，通过对发酵培养过程中的各种参数优化控制，获得目的蛋白的高效表达，可收获大量的生物产物。利用本专利技术提供的大肠杆菌发酵培养基，培养得到的生物湿菌产量不低于常规培养基(含蛋白胨)，经过发酵过程的优化，生物湿菌产量可由20g/L提高至30g/L。目的蛋白产量约2.4～3.0mg/g。附图说明图1为本专利技术实施例1中3个实验组的菌体生长曲线。图2为本专利技术实施例1中质粒稳定性检测结果。其中，A：F20190119质粒丢失率检测平板图，B：F20190121质粒丢失率检测平板图，C：F20190123质粒丢失率检测平板图。图3为本专利技术实施例1中SDS-PAEG检测菌体蛋白表达情况。其中，1：蛋白Marker，从上至下依次为98、66.2、45、31、20、14.4kD，2：无蛋白胨成分培养基，3：动物源成分培养基，4：植物源成分培养基。图4为本专利技术实施例1中SDS-PAEG检测硫酸铵沉淀蛋白纯度结果。其中，1：蛋白Marker，2：无蛋白胨成分培养基，3：动物源成分培养基，4：植物源成分培养基。图5为本专利技术实施例2中3个菌种的菌体生长曲线。图6为本专利技术实施例2中质粒稳定性检测结果。其中，A：菌种1质粒丢失率检测平板图，B：菌种2质粒丢失率检测平板图，C：菌种3质粒丢失率检测平板图。图7为本专利技术实施例2中SDS-PAEG检测菌体蛋白表达情况。其中，45菌体蛋白表达情况1：蛋白Marker，从上至下依次为98、66.2、45、31、20、14.4kD，2：45菌体蛋白，rEC菌体蛋白表达情况1：蛋白Marker，从上至下依次为98、66.2、45、31、20、14.4kD，2：rEC菌体蛋白，EECC菌体蛋白表达情况1：蛋白Marker，从上至下依次为98、66.2、45、31、20、14.4kD，2：EECC菌体蛋白。图8为本专利技术实施例2中SDS-PAEG检测硫酸铵沉淀蛋白纯度结果。其中，45菌体表达情况1：蛋白Marker，从上至下依次为98、66.2、45本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.大肠杆菌发酵培养基，其特征在于，包括如下组分：酵母提取物10-12g/L、磷酸氢二钠3-4g/L、磷酸二氢钾11.5-13.5g/L、硫酸铵1.5-2.5g/L、氯化铵0.5-1.0g/L、柠檬酸钠1.0-2.0g/L、葡萄糖10-12g/L和七水硫酸镁1.0-1.5g/L。/n

【技术特征摘要】
1.大肠杆菌发酵培养基，其特征在于，包括如下组分：酵母提取物10-12g/L、磷酸氢二钠3-4g/L、磷酸二氢钾11.5-13.5g/L、硫酸铵1.5-2.5g/L、氯化铵0.5-1.0g/L、柠檬酸钠1.0-2.0g/L、葡萄糖10-12g/L和七水硫酸镁1.0-1.5g/L。


2.根据权利要求1所述的发酵培养基，其特征在于，包括如下组分：酵母提取物10g/L、磷酸氢二钠4g/L、磷酸二氢钾13.5g/L、硫酸铵2.5g/L、氯化铵0.5g/L、柠檬酸钠2.0g/L、葡萄糖10g/L和七水硫酸镁1.0g/L。


3.权利要求1或2所述培养基在大肠杆菌发酵生产中的应用。


4.大肠杆菌发酵培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)一级种子制备；
2)二级种子制备；
3)将二级种子接入权利要求1所述培养基中，进行发酵培养。


5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述大肠杆菌为表达重组结核杆菌变态反应原的重组大肠杆菌pET28a-EECC/BL21(DE3)。


6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤1)包括：取200ul甘油管中保存的菌液加入装有200ml基础培养基的三角瓶中，37℃、200rpm振荡培养8-10小时，得到一级种子；
其中，所述基础培养基的配方为：酵母提取物10-12g/L、磷酸氢二钠3-4g/L、磷酸二氢钾11.5-13.5g/L、硫酸铵1.5-2.5g/L、氯化铵0.5-1.0g/L、柠檬酸钠1.0-2.0g/L和卡那霉素50mg/L。


7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤2)包括：按1‰v/v的比例将一级种子接种至装有200mL基础培养基的三角瓶中，37℃、200rpm振荡培养14-16小时，得到二级种子。


8.根据权利要求7所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：林兆新，杨晰朦，任永峰，贾羽，李福胜，
申请(专利权)人：扩增生物科技北京有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11