基于酞菁铜分子的诊疗一体化纳米探针及其制备和应用制造技术

本发明专利技术涉及一种基于酞菁铜分子集检测，成像，治疗于一体的纳米探针，所述纳米探针包括六方氮化硼纳米片，酞菁铜分子以及两组寡核苷酸结合序列。本发明专利技术所设计的两组寡核苷酸序列一端为用于检测和循环放大microRNA‑21的碱基对，另一端均为AS1411序列。AS1411序列既可以识别肿瘤细胞表面高表达的核仁素起靶向定位作用，又可以基于其特定条件下形成的G四连体来搭载水溶性较差的酞菁铜分子。继而，装载好酞菁铜的核苷酸序列通过π‑π堆积作用吸附在六方氮化硼纳米片表面进入肿瘤细胞中。本发明专利技术还公开了上述的诊疗一体化纳米探针在肿瘤细胞以及活体中的诊断与治疗中的应用。本发明专利技术的诊疗一体化纳米探针能够对肿瘤细胞进行原位拉曼诊断，灵敏度高，特异性强，且能够同时实现光动力治疗，在生物医药和临床诊疗上具有一定的应用价值。

Nano probe based on copper phthalocyanine and its preparation and Application

【技术实现步骤摘要】
基于酞菁铜分子的诊疗一体化纳米探针及其制备和应用
本专利技术涉及生物医学领域，尤其涉及一种基于酞菁铜分子的诊疗一体化纳米探针及其应用。
技术介绍
诊疗一体化是医学领域的新兴智能手段，是一种兼具诊断与治疗能力的协同系统，已成为癌症研究中被高度关注的关键词。理想情况下，智能有效的诊疗一体化探针应符合以下标准：(i)监测和治疗方式在疾病部位特异性激活，以避免背景干扰和副作用；特别是，用内源性癌症标志物激活探针是理想的，以提供精确的控制；(ii)探针应具有高检测灵敏度和治疗效力；(iii)监测和治疗方式需要在每个探针中相关联，以提供具有高可预测性和可控性的治疗能力。然而，到目前为止，将所有这些特征集成于单个探针仍然具有挑战性。目前普遍使用的诊断治疗主要依赖于荧光，磁共振成像或正电子发射断层扫描与化疗，基因治疗或放射治疗的组合诊疗。然而，这些检测方法存在选择性差和灵敏度低等一些缺点，导致诊断延迟，准确性差。同时，化疗和放疗会引起多药耐药和放射毒性，引起严重的副作用甚至肿瘤转移。此外，基因治疗引起的免疫反应和非预期的诱变限制了它们在临床中的实际应用。作为一种非侵入性技术，光动力疗法最近已被广泛探索为一种用于精确定位和治疗的有前景的方法。在基于光动力的治疗中，通过在特定区域激光照射光敏剂上，诱导活性氧(主要是细胞毒性单线态氧)的产生来破坏肿瘤细胞。因此，理想的光敏剂应具有高吸收系数，三重态的高量子产率和生理条件下的低细胞毒性。金属酞菁是一种具有18-π电子芳香族大环的二维分子，在中心腔处具有金属配位。酞菁化合物具有独特的性质，因其在光谱的红色部分(600-760nm)具有高摩尔吸光系数ε(约105M-1cm-1)，可允许激光穿透组织。此外，酞菁的低毒性使其有望成为光动力治疗的有效试剂。然而，传统光敏分子存在溶解性差和分子选择性低等缺陷，使其作为检测和治疗方式受到限制。
技术实现思路
为解决上述技术问题，本专利技术的目的在于提供一种基于酞菁铜分子的诊疗一体化纳米探针及其应用，所述纳米探针包括六方氮化硼纳米片，酞菁铜分子以及两组寡核苷酸结合序列。microRNA-21作为肿瘤细胞内高表达的标志物，已被广泛用于乳腺癌，胰腺癌，肠癌等术前诊断中。本专利技术所设计的两组寡核苷酸序列一端为用于检测和循环放大microRNA-21的碱基对，另一端均为AS1411序列。AS1411序列既可以识别肿瘤细胞表面高表达的核仁素起靶向定位作用，又可以基于其在特定条件(即退火)下形成的G四连体二级结构来搭载水溶性较差的酞菁铜分子。继而，装载好酞菁铜的核苷酸序列通过π-π堆积作用吸附在六方氮化硼纳米片表面进入肿瘤细胞中。本专利技术的纳米探针能够实现对肿瘤细胞内microRNA-21进行高灵敏度高选择性检测的同时，进行有效的光动力治疗。所述两组寡核苷酸结合序列之间可通过碱基互补结合，并可与microRNA-21部分互补连接；所述六方氮化硼纳米片与装载酞菁铜的AS1411修饰的寡核苷酸结合序列通过π-π堆积作用结合。本专利技术中，所述两组寡核苷酸结合序列分别为：5’-TCAGACTGATGTTCGTAGCTTATCAACATCAGTCTGATAAGCTATTTTTTTTGGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG-3’(SEQIDNO.1)和5’-TTCGTAGCTTATCAGACTGATGTTTGATAAGCTACGAACATCAGTTTTTTTTTGGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG-3’(SEQIDNO.2)。本专利技术中，所述AS1411序列为：5’-GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG-3’(SEQIDNO.3)。本专利技术中，所述六方氮化硼纳米片的粒径为80～100nm，优选地，粒径为90nm；厚度为14-16nm，优选地，厚度为15nm。本专利技术还提供了一种基于酞菁铜分子的诊疗一体化纳米探针的制备方法，利用化学合成以及物理吸附等方法制备得到；本专利技术首先通过化学合成和机械剥离合成六方氮化硼纳米片，通过退火作用(即，先在高温水浴锅中加热，然后缓慢冷却至室温)使两组寡核苷酸结合序列分别形成G四连体二级结构，继而搭载酞菁铜分子构建酞菁铜-核苷酸复合物；然后通过π-π堆积作用吸附在六方氮化硼纳米片共同孵育，得到所述基于酞菁铜分子的诊疗一体化探针。具体包括以下步骤：(1)六方氮化硼纳米片的制备在浓硫酸中，六方氮化硼粉末，高锰酸钾(KMnO4)和过氧化氢(H2O2)进行水热反应，然后再通过超声处理，得到所述的六方氮化硼纳米片。(2)酞菁铜-核苷酸序列复合物的制备(2-1)将两组寡核苷酸结合序列溶于缓冲液中，然后在水浴锅中加热一定时间，缓慢冷却至室温，形成二级结构(HG1和HG2)。(2-2)将得到的二级结构(HG1和HG2)与酞菁铜分子震荡孵育，得到酞菁铜-核苷酸序列复合物(CuPc@HG)。(3)诊疗一体化探针的制备将上述步骤(2)制备的酞菁铜-核苷酸序列复合物与步骤(1)制备的六方氮化硼纳米片震荡孵育，采用缓冲液洗涤三次，得到所述基于酞菁铜分子的诊疗一体化探针(CuPc@HG@BN)；其中，所述酞菁铜-核苷酸序列的复合物与六方氮化硼纳米片通过物理吸附π-π堆积结合。步骤(1)中，所述水热反应的温度优选为冰浴，0℃。步骤(1)中，所述水热反应的时间为10～14h；优选地，为12h。步骤(1)中，所述超声的条件为85-110kW；优选地，为100kW。步骤(1)中，所述超声的时间为0.5～2h；优选地，为1h。步骤(1)中，所述超声的作用是机械剥离。步骤(1)中，所述六方氮化硼粉末，高锰酸钾和过氧化氢的质量比为(1-2)：(0.5-1.5)：(8-11)；优选地，为2：1：10。本专利技术通过采用水热反应和机械剥离(超声处理)的方法相结合，获得了粒径为80～100nm(小于150nm)，且形状趋于圆形的六方氮化硼纳米片，相较于现有其他方法，获得的六方氮化硼纳米片粒径更小，形状趋于圆形，因而更适于用于细胞及活体中的分析检测。在一具体实施方式中，所述六方氮化硼纳米片的制备包括：在磁力搅拌下，在0℃条件下，将六方氮化硼粉末分散在一定量的浓硫酸中。将KMnO4缓慢加入混合体系中，并继续搅拌反应12h。然后向反应体系中加入H2O2反应1h。将所得悬浮液超声处理1小时，然后以10000rpm离心10分钟以除去大的氮化硼粉末。用超纯水洗涤上层液体直至滤液的pH值为中性。最后，将产物置于真空烘箱中，在60℃下干燥24小时，得到六方氮化硼纳米片。其中，六方氮化硼粉末为1g，高锰酸钾为0.5g，过氧化氢为10ml。步骤(2-1)中，所述两组寡核苷酸结合序列分别为5’-TCAGACTGATGTTCGTAGCTTATCAACATCAGTCTGATAAGCTATTTTTTTTGGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG-3’(SEQIDNO.1)和5’-TTCGTA本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于酞菁铜分子的诊疗一体化纳米探针，其特征在于，所述诊疗一体化纳米探针包括六方氮化硼纳米片，酞菁铜分子以及两组寡核苷酸结合序列；其中，所述两组寡核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1～2所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种基于酞菁铜分子的诊疗一体化纳米探针，其特征在于，所述诊疗一体化纳米探针包括六方氮化硼纳米片，酞菁铜分子以及两组寡核苷酸结合序列；其中，所述两组寡核苷酸序列分别如SEQIDNO.1～2所示。


2.根据权利要求1所述的基于酞菁铜分子的诊疗一体化纳米探针，其特征在于，所述寡核苷酸序列为AS1411修饰。


3.根据权利要求2所述的基于酞菁铜分子的诊疗一体化纳米探针，其特征在于，所述寡核苷酸序列装载酞菁铜分子；所述六方氮化硼纳米片与装载酞菁铜分子的AS1411修饰的寡核苷酸结合序列通过π-π堆积作用结合。


4.根据权利要求1所述的基于酞菁铜分子的诊疗一体化纳米探针，其特征在于，所述六方氮化硼纳米片的粒径为80～100nm，厚度为14-16nm。


5.一种基于酞菁铜分子的诊疗一体化纳米探针的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)六方氮化硼纳米片的制备
在浓硫酸中，六方氮化硼粉末，高锰酸钾和过氧化氢进行水热反应，然后再通过超声处理，得到所述的六方氮化硼纳米片；
(2)酞菁铜-核苷酸序列复合物的制备
(2-1)将两组寡核苷酸结合序列溶于缓冲液中，分别在水浴锅中加热，然后缓慢冷却至室温，形成二级结构HG1和HG2；
(2-2)将得到的二级结构HG1和HG2与酞菁铜分子孵育，得到酞菁铜-核苷酸序列复合物CuPc@HG；
(3)诊疗一体化探针的制备
将步骤(2)制备的酞菁铜-核苷酸序列复合物与步骤(1)制备的六方氮化硼纳米片混合孵育，得到所述基于酞菁铜分子的诊疗一体化探针CuPc@HG@BN。


6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述水热反应的温度为0℃；和/或，所述水热反应的时间为10～14h；和/或，所述六方氮化硼粉末，高锰酸钾和过氧化氢的质量比为(1-2)：...

【专利技术属性】
技术研发人员：田阳，刘嘉，郑婷婷，
申请(专利权)人：华东师范大学，
类型：发明
国别省市：上海;31