一种基于实时荧光定量PCR检测土壤细菌数量的方法技术

本发明专利技术公开了一种基于实时荧光定量PCR检测土壤细菌数量的方法，属于生物技术领域。本方法包括以下步骤：1)提取土壤样品总DNA并调整到预设浓度，制备成待测土壤样品模板DNA溶液；2)提取模板大肠杆菌总DNA，测定DNA浓度，并制备标准曲线模板DNA溶液；3)对待测土壤样品模板DNA溶液和标准曲线模板DNA溶液进行实时荧光定量PCR扩增；4)绘制出标准曲线；5)计算每克干土中细菌数量。本方法省去添加内标菌株荧光镜检等步骤，大大降低操作难度；且不需要经过连接、转化，再以qPCR扩增，操作简便易学；目标片段特异性好，数据精准度高，重现性好。

A real-time fluorescence quantitative PCR based method to detect the number of soil bacteria

【技术实现步骤摘要】
一种基于实时荧光定量PCR检测土壤细菌数量的方法
本专利技术属于生物
，具体涉及一种基于实时荧光定量PCR检测土壤细菌数量的方法。
技术介绍
土壤细菌不仅是土壤生态系统中的核心物种，也是最丰富多样的微生物分类，约占微生物总数的90％。土壤细菌调控碳氮等元素循环和有机质矿化过程，对土壤生物化学过程和能量流动具有十分重要的作用。其中氮元素(如固氮作用、硝化作用和反硝化作用)、磷元素(解磷)以及钾元素(解钾)等循环功能只能由土壤细菌完成。由于土壤细菌数量是表征微生物群落大小和功能的一个重要指标，越来越多研究重视环境污染、土地利用和人为扰动对土壤细菌的影响，以及土壤细菌在环境监测、土壤修复、微生物肥料等方面有巨大的应用潜力。同时，由于细菌数量受到土壤类型、土地利用方式、人为干扰、环境污染和土壤理化性质等众多因素影响。因此，提供一种简单迅速、可批量操作和结果精准的细菌数量检测方法具有重要的意义。目前，我国土壤细菌数量测定方法采用稀释平板法、最大或然法、镜检计数法、荧光显微计数法和高通量测序等方法，但存在着方法粗放烦琐、与国际先进方法脱轨或成本较高等诸多问题。以稀释平板法为例，由于只有很少一部分细菌可以人工培养，因此局限性很大，不能获得细菌数量的可靠信息；荧光计数法虽灵敏度高，但前期处理费时费力，且受抗褪色剂附着量和染料荧光淬灭因素影响，观察计数准确度不高；高通量测序与内标菌株荧光镜检相结合的方法虽精准度高，但成本较高，且对操作技术和实验设备要求较高，并不适合推广。CN107653300A公开了一种测定土壤样品DNA提取率的方法，通过qPCR对比添加到土壤样品中内标基因拷贝数和提取之后样品中内标基因拷贝数计算DNA提取率，具有快速、高效鉴定土壤DNA提取效果的特点，但其方法只能对土壤样品内细菌、真菌、古菌等物种总DNA提取好坏及土壤对总DNA的吸附度进行鉴定，并不能获取土壤内细菌绝对数量的可靠信息。CN106011256A公开了一种基于实时荧光定量PCR检测小麦土壤中丛枝菌根真菌数量的方法，在建立标准曲线的基础上可以对相应的特定细菌或真菌进行绝对定量，具有高度特异、灵敏、快速的特点，但其方法需要经过连接、转化，再进行qPCR扩增，需配置培养基并准备感受态细胞及提取质粒，检测步骤繁琐。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术的目的是提供一种基于实时荧光定量PCR检测土壤细菌数量的方法，以解决稀释平板法不能获得细菌数量的可靠信息；荧光计数法受抗褪色剂附着量和染料荧光淬灭因素影响，观察计数准确度不高；高通量测序不适宜推广以及qPCR定量检测需配置培养基并准备感受态细胞及提取质粒，检测步骤繁琐的问题。为了实现上述专利技术目的，本专利技术采用的技术方案为：一种基于实时荧光定量PCR检测土壤细菌数量的方法，包括以下步骤：1)提取土壤样品总DNA并调整到预设浓度，制备成待测土壤样品模板DNA溶液；2)提取模板大肠杆菌总DNA，测定DNA浓度，并制备标准曲线模板DNA溶液；3)对待测土壤样品模板DNA溶液和标准曲线模板DNA溶液进行实时荧光定量PCR扩增，并以标准曲线模板DNA溶液的目标特异性片段拷贝10的幂数和测定的循环数Ct值绘制出标准曲线，y＝ax+b；其中y为循环数Ct，x为目标特异性片段拷贝10的幂数；4)计算待测土壤样品的目标特异性片段总拷贝数N＝10(Ct-b)/a；5)计算待测样品每克干土的细菌数量＝(c*V*N)/(cr*Vr*m)；式中，c为土壤样品提取的初始DNA浓度，cr为待测土壤样品模板DNA调整的预设浓度，V为每个土壤样品提取模板DNA的总体积，Vr为实时荧光定量PCR的扩增体系中加入的土壤样品模板DNA的体积，m为用于提取模板DNA的土壤样品干重。进一步的，步骤1)中，预设浓度为4-6ng/μL。进一步的，模板大肠杆菌为EscherichiacoliH673。进一步的，目标特异性片段为细菌16SrRNA基因序列。进一步的，标准曲线模板DNA溶液的制备方法为：根据模板大肠杆菌基因碱基数和质量及其目标特异性片段拷贝数，计算出标准曲线模板DNA母液中的目标特异性片段拷贝浓度，并取母液依次进行稀释，制得标准曲线模板DNA溶液。进一步的，实时荧光定量PCR的扩增体系为：DNA模板5μL，10μM上游引物0.5μL，10μM下游引物0.5μL，2×LunaSYBRqPCR混合液10μL，ddH2O补足至20μL；实时荧光定量PCR的反应步骤为：95℃预变性5min；95℃变性15s，55℃退火+延伸1min，30个循环。进一步的，上游引物的序列为5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’；下游引物的序列为5’-ATTACCGCGGCTGCTGG-3’。有益效果：与现有技术相比，本专利技术具有以下优点：1)本方法省去添加内标菌株荧光镜检等步骤，大大降低操作难度；且不需要经过连接、转化，再以qPCR扩增，操作简便易学；2)目标片段特异性好，数据精准度高；3)标准曲线具有较高的线性(R2＞0.99)和正常的扩增效率(E：90-105％)，具有良好的重现性。附图说明图1是96孔荧光定量板及加样排列方式示意图；图中，C8-C4分别为标准曲线模板DNA108copy/5μL-104copy/5μL的qPCR扩增体系；S1-S27分别为待测土壤样品模板DNA的qPCR扩增体系。具体实施方式下面结合具体实施例进一步说明本专利技术，但这些实施例并不用来限制本专利技术。实施例1本实施例所使用的土壤采自江苏省南京市紫金山(32°01′N，118°49＇E)北麓施肥竹林与未施肥竹林，土壤类型为黄棕壤，呈弱酸性。距树主干0.5m左右除去枯枝落叶层，用灭菌50mL离心管取表层土壤(0—10cm)，处理1为施肥竹林土壤，处理2为未施肥竹林土壤，各处理3次重复，用上述方法进行土壤细菌数量检测。具体操作步骤如下：1)将土壤样品过2mm筛以去除石子、树根和落叶等杂物，称取0.3g左右的新鲜土壤，利用OMEGA土壤DNA提取试剂盒(OMEGAE.Z.N.A.土壤DNA提取试剂盒类型为50次/盒，货号D5625-01)提取土壤总DNA，溶于ddH2O中，测定DNA浓度，冷冻于-20℃冰箱备用。2)将接种在LB液体培养基(胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，加水至1000mL，用氢氧化钠将pH调节至7.4)的模板大肠杆菌(EscherichiacoliH673；购于芬兰赫尔辛基大学细菌菌种库)于37℃条件下震荡(200rpm)培养12h。吸取2mL细菌培养液高速离心后，将沉淀菌体利用CTAB法提取总DNA，溶于ddH2O中，制备成标准曲线模板DNA母液，测定DNA浓度，冷冻于-20℃冰箱备用。并利用已知的大肠杆菌基因组碱基数(4.6Mb)和质量(5.0416×10-6ng)及其目标特异性片段拷贝数(7个/基因组)，计本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于实时荧光定量PCR检测土壤细菌数量的方法，其特征在于，包括以下步骤：/n1)提取土壤样品总DNA并调整到预设浓度，制备成待测土壤样品模板DNA溶液；/n2)提取模板大肠杆菌总DNA，测定DNA浓度，并制备标准曲线模板DNA溶液；/n3)对待测土壤样品模板DNA溶液和标准曲线模板DNA溶液进行实时荧光定量PCR扩增，并以标准曲线模板DNA溶液的目标特异性片段拷贝10的幂数和测定的循环数Ct值绘制出标准曲线，y＝ax+b；其中y为循环数Ct，x为目标特异性片段拷贝10的幂数；/n4)计算待测土壤样品的目标特异性片段总拷贝数N＝10

【技术特征摘要】
1.一种基于实时荧光定量PCR检测土壤细菌数量的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)提取土壤样品总DNA并调整到预设浓度，制备成待测土壤样品模板DNA溶液；
2)提取模板大肠杆菌总DNA，测定DNA浓度，并制备标准曲线模板DNA溶液；
3)对待测土壤样品模板DNA溶液和标准曲线模板DNA溶液进行实时荧光定量PCR扩增，并以标准曲线模板DNA溶液的目标特异性片段拷贝10的幂数和测定的循环数Ct值绘制出标准曲线，y＝ax+b；其中y为循环数Ct，x为目标特异性片段拷贝10的幂数；
4)计算待测土壤样品的目标特异性片段总拷贝数N＝10(Ct-b)/a；
5)计算待测样品每克干土的细菌数量＝(c*V*N)/(cr*Vr*m)；式中，c为土壤样品提取的初始DNA浓度，cr为待测土壤样品模板DNA调整的预设浓度，V为每个土壤样品提取模板DNA的总体积，Vr为实时荧光定量PCR的扩增体系中加入的土壤样品模板DNA的体积，m为用于提取模板DNA的土壤样品干重。


2.根据权利要求1所述的基于实时荧光定量PCR检测土壤细菌数量的方法，其特征在于，步骤1)中，预设浓度为4-6ng/μL。


3.根据权利要求1所述的基于实时荧光定量PCR检测土壤细菌数量的方法，其特征在于，所述模板大肠杆菌为Es...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘兵，马阳，曲朝磊，徐杰，耿莉，孙辉，
申请(专利权)人：南京林业大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32