【技术实现步骤摘要】
创伤弧菌的核酸快速恒温检测方法及应用本申请是2016年8月30日提交的、申请号为201610767402.3、专利技术名称为:“快速恒温检测创伤弧菌的方法、引物及试剂盒和应用”的中国专利技术专利申请的分案申请;该母案申请要求申请日为2015年9月2日、申请号为201510556917.4、专利技术名称为“快速恒温检测阪崎克罗诺杆菌的方法、引物及试剂盒”的中国专利技术专利申请的优先权。
本专利技术属于生物
,具体涉及一种快速恒温检测创伤弧菌的方法、引物及试剂盒。
技术介绍
创伤弧菌(Vibriovulnificus),又称海洋弧菌,是在海水和一些海洋食品中发现的一种嗜盐性革兰氏阴性致病菌。人类通常是因为生食受污染的海产品,或者伤口接触受污染的海水或海洋动物而感染该细菌,可引起原发性败血症、创伤感染和急性胃肠炎等症状,其中引起的败血症性休克的死亡率高达50%以上。在我国,创伤弧菌感染多发生于沿海地区,被列为食品污染源中八大高危微生物之一。此外,由创伤弧菌引起的最初症状并无明显特异性,因此对该菌的预防和检测尤为重要。目前,针对创伤弧菌的检测主要通过病原分离与生化鉴定完成,但存在检测周期长,操作繁琐,不易鉴别相近物种等缺点。近年来随着核酸分子检测技术的发展,以特异性基因为靶标建立的常规PCR或real-timePCR技术已成功应用于创伤弧菌的实验室诊断,具有灵敏度高,检测时间短等优点,但该方法必须配备昂贵的仪器设备,需专门的操作人员。因此,并不适合广泛应用于基层检测部门尤其是企业生产线内部进行的实时实地 ...
【技术保护点】
1.一种针对创伤弧菌的快速恒温检测方法,其特征在于,包括以下步骤:/n(1)从待测样品中提取基因组DNA;/n(2)以所述基因组DNA为模板,以能扩增创伤弧菌基因组特异性碱基序列的引物组作为引物,在酶反应体系下进行恒温扩增反应;/n(3)通过判断反应结果是否为阳性,确定待测样品中是否存在创伤弧菌;/n其中,所述创伤弧菌基因组特异性碱基序列为GI号为320154846的创伤弧菌基因组的112393~113296bp位序列;/n其中,所述能扩增创伤弧菌基因组特异性碱基序列的引物组选自以下引物组D、E、E’、F、F’之任意一组;/n引物组D:/n上游外引物F3_D:5’-CAAGTGGAAGTGTATCACC-3’(SEQ ID NO:13);/n下游外引物B3_D:5’-GGAATAATGTACGACTCCTG-3’(SEQ ID NO:14);/n上游内引物FIP_D:5’-ATGCTTGTCGTCTTTCACCGCTCTAAAGATGAGATGATCGC-3’(SEQ IDNO:15);/n下游内引物BIP_D:5’-GTTGCCTCGAAATGCATTAACTCTCTTGCGGATG ...
【技术特征摘要】
20150902 CN 20151055691741.一种针对创伤弧菌的快速恒温检测方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)从待测样品中提取基因组DNA;
(2)以所述基因组DNA为模板,以能扩增创伤弧菌基因组特异性碱基序列的引物组作为引物,在酶反应体系下进行恒温扩增反应;
(3)通过判断反应结果是否为阳性,确定待测样品中是否存在创伤弧菌;
其中,所述创伤弧菌基因组特异性碱基序列为GI号为320154846的创伤弧菌基因组的112393~113296bp位序列;
其中,所述能扩增创伤弧菌基因组特异性碱基序列的引物组选自以下引物组D、E、E’、F、F’之任意一组;
引物组D:
上游外引物F3_D:5’-CAAGTGGAAGTGTATCACC-3’(SEQIDNO:13);
下游外引物B3_D:5’-GGAATAATGTACGACTCCTG-3’(SEQIDNO:14);
上游内引物FIP_D:5’-ATGCTTGTCGTCTTTCACCGCTCTAAAGATGAGATGATCGC-3’(SEQIDNO:15);
下游内引物BIP_D:5’-GTTGCCTCGAAATGCATTAACTCTCTTGCGGATGAATGATT-3’(SEQIDNO:16);
引物组E:
上游外引物F3_E:5’-CAACGTATAGTTACCTAGCCGC-3’(SEQIDNO:17);
下游外引物B3_E:5’-CGGGTCAGTGGATTTGCTC-3’(SEQIDNO:18);
上游内引物FIP_E:5’-CGCACAAACACAAAGAGCACCTTGGCTTAACGATAGCTACGC-3’(SEQIDNO:19);
下游内引物BIP_E:
5’-GAGACGACGTTGGTTTAAGCCCAACGTTGAGTTTGCACACATGG-3’(SEQIDNO:20);
引物组E’:
上游外引物F3_E:5’-CAACGTATAGTTACCTAGCCGC-3’;
下游外引物B3_E:5’-CGGGTCAGTGGATTTGCTC-3’;
上游内引物FIP_E:5’-CGCACAAACACAAAGAGCACCTTGGCTTAACGATAGCTACGC-3’;
下游内引物BIP_E:
5’-GAGACGACGTTGGTTTAAGCCCAACGTTGAGTTTGCACACATGG-3’;
下游环引物LB_E:5’-GATCGATTCACCCGCGTGCT-3’(SEQIDNO:26);
引物组F:
上游外引物F3_F:5’-TCGAAACACAAAGAGCACCG-3’(SEQIDNO:21);
下游外引物B3_F:5’-AATCGCCAAGAGCCGATG-3’(SEQIDNO:22);
上游内引物FIP_F:5’-GGGTGAATCGATCGATTGGGCTTAGGTGCTCTTTGTGTTTGTGC-3’(SEQIDNO:23);
下游内引物BIP_F:5’-GACCATGTGTGCAAACTCAACGCGAAATCCGGCGGTTTCCA-3’(SEQIDNO:24);
引物组F’:
上游外引物F3_F:5’-TCGAAACACAAAGAGCACCG-3’;
下游外引物B3_F:5’-AATCGCCAAGAGCCGATG-3’;
上游内引物FIP_F:
5’-GGGTGAATCGATCGATTGGGCTTAGGTGCTCTTTGTGTTTGTGC-3’;
下游内引物BIP_F:5’-GACCATGTGTGCAAACTCAACGCGAAATCCGGCGGTTTCCA-3’;
上游环引物LF_F:5’-AACGTCGTCTCACACCAGCAA-3’(SEQIDNO:27);
和/或,下游环引物LB_F:5’-GAGCAAATCCACTGACCCGCT-3’(SEQIDNO:28)。
2.如权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(2)中,所述酶反应体系包括:1×BstDNA聚合酶反应缓冲液,2-9mmol/LMg2+,1.0-1.6mmol/LdNTP,0.8-2.0μmol/L的FIP和BIP引物,0.15-0.3μmol/L的F3和B3引物,0.16-0.64U/μLBstDNA聚合酶,0-1.5mol/L的甜菜碱,包括或不包括0.4-1.0μmol/L的LF和/或LB引物。
3.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述恒温扩增反应的反应程序为:①60~65℃孵育10~90min;②80℃终止反应2~20min。
4.用于针对创伤弧菌的快速恒温检测的引物,其特征在于,所...
【专利技术属性】
技术研发人员:曹永梅,李雪玲,李园园,韦朝春,刘伟,贾犇,陆长德,李亦学,
申请(专利权)人:上海旺旺食品集团有限公司,上海产业技术研究院,
类型:发明
国别省市:上海;31
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