传感器制造技术

本发明专利技术涉及用于检测靶标核酸的单核苷酸多态性(SNP)或单核苷酸修饰的基因探针，基因探针包含：‑纳米颗粒；‑锚定至纳米颗粒表面的寡核苷酸探针，其包含具有通过接头基团并入其中的标签的寡核苷酸主链；和‑锚定至所述纳米颗粒表面的参比探针，其中参比探针包含标志物；其中(a)标签是有机荧光标签并且标志物是基于过渡金属的荧光标志物；或者(b)标签是氧化还原活性标签并且标志物是基于过渡金属的氧化还原活性标志物。本发明专利技术还涉及含有本发明专利技术的探针的组合物或试剂盒，或者涉及本发明专利技术的探针的应用。本发明专利技术还涉及确定靶标核酸混合池中的靶标核酸的单核苷酸多态性(SNP)或单核苷酸修饰的百分比的方法，或者涉及确定受试者中与已知的SNP有关的病况状态的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】传感器本专利技术涉及用于检测靶标核酸的单核苷酸多态性(SNP)或单核苷酸修饰的基因探针，以及确定靶标核酸混合池中的靶标核酸的单核苷酸多态性(SNP)或单核苷酸修饰的百分比的方法。
技术介绍
单核苷酸多态性(SNP)是基因组DNA的特定序列中一个位点处的一个核碱基的变化，其在包括癌症在内的具有遗传组分的疾病的发展和预后中起重要作用。在临床研究、手术和诊断中，需要从等位基因(即SNP)比值中提供快速、廉价且可靠的读数的方法以提供临床决策信息。几种用于鉴别SNP组成的商品化测定是已知的，例如，TaqMan。然而，尽管可以容易地将杂合性等位基因(即来自含有两种SNP变体的两种DNA拷贝的样品)与它们的纯合对应物(即两个相同拷贝)相区分，但是它仍难以定量含有非50/50的核碱基比的样品。这种情况可以出现在癌性组织区域中，其中突变程度(将提供通过手术除去的组织的量的信息)是未知的。或者，它可以出现在杂合mRNA转录本中，其中转录了两种DNA拷贝，但是一种大于另一种；这种情况可以指示与特定疾病有关的转录中的误调控。最近，开发了SNP检测方法，其中可以常规地从DNA靶标样品中读出SNP类型(参见Duprey等人,ACSChem.Biol.,2016,11,717-721；Zhao等人,Biorg.Med.Chem.Lett.,2012,22,129；Duprey等人,Chem.Commun,2011,47,6629；和Li等人,Anal.Chem.,2016,88,883–889)。与多种其他方法，包括商品化的那些一样，这种方法使用了涉及标签DNA探针的双螺旋形成(杂交)以产生荧光信号。然而，这种方法中的一种差异在于所述分析基于双螺旋形成时所产生的信号强度(即信号强度)，而不是基于双螺旋形成的好坏程度来提供信号。这意味着所述测定可以在室温下进行并且避免了对使用狭窄温度窗以确保仅一个转录本(或转录本产物)结合的需要。所述检测信号来自双螺旋形成时在特定监测波长(例如，426nm)升高或降低的探针链上的蒽标签的荧光发射，其中信号强度直接取决于相对碱基的类型(参见图1)。Duprey等人(ACSChem.Biol.,2016,11,717-721)还证明杂交SNP检测方法还可以区分碱基修饰(例如，胞嘧啶的甲基化或鸟嘌呤的氧化)以及碱基变化。本专利技术的目标是提供改善的SNP检测方法和提供用于这种SNP检测的改善的探针。
技术实现思路
根据本专利技术的第一方面，提供了用于检测靶标核酸的单核苷酸多态性(SNP)或单核苷酸修饰的基因探针，基因探针包含：-纳米颗粒；-锚定至纳米颗粒表面的寡核苷酸探针，其包含具有通过接头基团并入其中的标签的寡核苷酸主链；和-锚定至纳米颗粒表面的参比探针，其中参比探针包含标志物；其中(a)标签是有机荧光标签并且所述标志物是基于过渡金属的荧光标志物；或者(b)标签是氧化还原活性标签并且所述标志物是基于过渡金属的氧化还原活性标志物。适合地，标签能够在双链寡核苷酸的相邻碱基对之间部分插入和堆叠。适合地，标志物不能够在双链寡核苷酸的相邻碱基对之间部分插入和堆叠。将理解尽管本专利技术申请的工作实施例利用了使用荧光的实施方式(a)，但是可以同样地使用利用电化学信号的实施方式(b)来实施本专利技术。在另一个方面，还提供了包含根据本专利技术的第一方面的多种基因探针的组合物。这可以包含两个或更多个，或者5个或更多个，或者10个或更多个，或者50个或更多个，或者100个或更多个根据本专利技术的第一方面的基因探针。组合物可以是溶液或混悬液。基因探针溶液可以具有至少0.1nM，至少0.5nM，至少1nM或至少5nM的浓度。组合物可以在水介质，例如，缓冲液中包含多个基因探针。组合物可以包含一种或多种其他物质，如聚合物、溶剂、生物流体、蛋白、表面活性剂和稳定剂。在一些实施方式中，组合物包含聚丙烯酰胺、阴离子表面活性剂(例如，氟化表面活性剂，如FSA)、牛血清白蛋白(BSA)和/或血清(例如，人血清或胎牛血清)。聚丙烯酰胺能够使纳米颗粒干燥和再混悬。在一些实施方式中，组合物包含聚丙烯酰胺。可以将聚丙烯酰胺制备为溶液(例如，1mg/ml水溶液)，将其以所需要的量(例如，0.1至1％v/v)加入至包含纳米颗粒的组合物中。在一些实施方式中，组合物包含阴离子表面活性剂(例如，FSA)。阴离子表面活性剂的浓度可以为0.01至0.1％(v/v)。在一些实施方式中，组合物包含血清(例如，人血清或胎牛血清)。血清的浓度可以为0.2％至2％(v/v)。在一些实施方式中，组合物包含牛血清白蛋白(BSA)。可以将BSA制备为溶液(例如，1mg/ml水溶液)，将其以所需要的量(例如，0.1至1％v/v)加入至包含纳米颗粒的组合物中。本专利技术的基因探针提供了可以准确确定来自DNA样品(例如，在来自癌性组织区域的那些中)或者来自mRNA转录本的等位基因比例的用于杂合核酸样品的快速、廉价和定量评价。寡核苷酸主链与所关心的靶标链形成双螺旋。它可以设计与靶标链互补。可以通过有机荧光标签发光强度的变化来检测单碱基变化。本专利技术使得能够比率检测(ratiometricsensing)，借此分析在两个不同波长下来自两个不同荧光团的检测信号。将一个信号强度除以另一个避免了确定初始探针浓度的需要；这简化且有利于检测方法，具体地其中探针浓度将难于确定的细胞环境中的分析。以类似的方式，在本专利技术的电化学实施方式中，可以分析来自两个不同的氧化还原活性材料的电流(或所产生的电荷)。本专利技术允许比率系统，其使得能够检测不同的SNP变体，而不需要每个实验的基线发光水平。一旦合成了新批次的本专利技术的基因探针，可以测量荧光标签与基于过渡金属的荧光标志物信号的比值，然后该比值可以用于使用该批次的所有后续实验。如果当归一化时，比值加倍，则存在错配的CA碱基对；然而如果比值减半，则存在匹配的CG碱基对。同样地，可以计算和使用来自氧化还原活性标签的电流(或所产生的电荷)与来自氧化还原活性标志物的电流(或所产生的电荷)的比值。不需要每个实验的基线发光水平克服了当检测细胞内的SNP靶标时，仅能进行单一蒽发光测量的问题。本专利技术所提供的比率检测法还克服了在探针细胞吸收中不同的问题。只要对于探针存在过量的靶标，则所测量的标签信号与标志物信号的比值将对于每个细胞中所存在的SNP提供准确读数。尽管比率检测本身并不是新的，但是以其中它们单独固定在纳米颗粒上的形式提供第一探针和第二(标准/参比)探针是新的。这是有利的，因为它提供了其中一起提供两种探针的稳定环境，并且存在在测试环境中两种探针的浓度相同的确定性，但是另外第二探针不与第一探针相互作用并因此一旦第一探针与不同靶标杂交时，其发光/信号不波动。相反，先前对于使用荧光团的比率检测的努力遇到了问题：一旦结合至靶标，则第二荧光团显著波动。因此，本专利技术的基因探针是有益的，其中它可以用于提供可靠的不依赖于浓度的第一探针的发光/信号水平。本专利技术的基本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于检测靶标核酸的单核苷酸多态性(SNP)或单核苷酸修饰的基因探针，所述基因探针包含：/n-纳米颗粒；/n-锚定至所述纳米颗粒表面的寡核苷酸探针，其包含具有通过接头基团并入其中的标签的寡核苷酸主链；和/n-锚定至所述纳米颗粒表面的参比探针，其中所述参比探针包含标志物；/n其中(a)所述标签是有机荧光标签并且所述标志物是基于过渡金属的荧光标志物；或者(b)所述标签是氧化还原活性标签并且所述标志物是基于过渡金属的氧化还原活性标志物。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170901 GB 1714068.21.用于检测靶标核酸的单核苷酸多态性(SNP)或单核苷酸修饰的基因探针，所述基因探针包含：
-纳米颗粒；
-锚定至所述纳米颗粒表面的寡核苷酸探针，其包含具有通过接头基团并入其中的标签的寡核苷酸主链；和
-锚定至所述纳米颗粒表面的参比探针，其中所述参比探针包含标志物；
其中(a)所述标签是有机荧光标签并且所述标志物是基于过渡金属的荧光标志物；或者(b)所述标签是氧化还原活性标签并且所述标志物是基于过渡金属的氧化还原活性标志物。


2.根据权利要求1所述的基因探针，其中所述纳米颗粒由选自以下各项的材料形成：金属、金属氧化物、二氧化硅、石墨烯和量子点。


3.根据权利要求2所述的基因探针，其中所述纳米颗粒由贵金属形成。


4.根据以上权利要求中任一项所述的基因探针，其中所述寡核苷酸主链的长度为8个或更多个核苷酸。


5.根据以上权利要求中任一项所述的基因探针，其中所述接头基团位于距锚定至所述纳米颗粒表面的寡核苷酸末端5个或更多个核苷酸。


6.根据以上权利要求中任一项所述的基因探针，其中所述标签是平面芳烃或杂芳烃部分或者平面大环过渡金属络合物。


7.根据以上权利要求中任一项所述的基因探针，其中所述标签是基于以下化学品家族中的任一种的荧光标签：噻嗪，或菁，或芘，或占吨，或吖啶，或蒽，或蒽醌。


8.根据权利要求7所述的基因探针，其中所述荧光标签是噻唑橙、芘、占吨、蒽、蒽醌或吖啶或其衍生物。


9.根据权利要求1-6中任一项所述的基因探针，其中所述标签是基于以下化学品家族中的任一种的氧化还原活性标签：菲啶、酚噻嗪、吩嗪、吖啶、蒽醌；或者所述标签基于含有插入配体的金属络合物；或者所述标签基于平面大环过渡金属络合物。


10.根据权利要求9所述的基因探针，其中所述氧化还原活性标签选自4-配位大环过渡金属络合物，其中环配体化合物是平面的并且环尺寸为10或以上，并且其中所述金属是钴Co(II)、镍Ni(II)、铜Cu(II)或铁Fe(II)。


11.根据权利要求10所述的基因探针，其中所述环配体的环尺寸为14并且环包括两个或更多个双键。


12.根据权利要求11所述的基因探针，其中所述氧化还原活性标签是具有如下所示的cyclidene[14]配体的过渡金属络合物：



其中M是Ni(II)或Cu(II)，并且其中存在可选地从环延伸出的一个或多个侧基，所述侧基选自羟基、羧基、C1-4烷基、氨基(NR'2，其中每个R'独立地选自H和C1-4烷基)、C1-C4醚和C1-C4酯。


13.根据以上权利要求中任一项所述的基因探针，其中所述接头基团如式(I)所示：



其中
L连接至标签并且选自C3-16烷基(例如，C3-14或C3-12或C3-10烷基)、C3-16烯基(例如，C3-14或C3-12或C3-10烯基)和C3-16炔基(例如，C3-14或C3-12或C3-10炔基)，
其中一个、二个或三个碳原子可以可选地被杂原子取代，所述杂原子独立地选自O、S和N，
并且其中一个、二个、三个或四个氢原子可以可选地被独立地选自以下各项的基团取代：羟基、羧基、氨基(NR'2、其中每个R'独立地选自H和C1-4烷基)、C1-C4烷氧基、C1-C4醚、C1-C4硫醚、硝基、腈、C1-C4酯、苯基、吡啶基、嘧啶基、呋喃基、吡咯基、苯硫基、咪唑基和噻唑基；
A、B和Z分别独立地选自氢、C1-4烷基、氨基(NR'2，其中每个R'独立地为选自H和C1-4烷基)和C1-4烷氧基。


14.根据权利要求13所述的基因探针，其中所述接头基团如式(Ib)所示



其中n是1至7的整数，例如，1、2、3、4、5、6或7。


15.根据以上权利要求中任一项所述的基因探针，其中所述标志物是基于过渡金属的荧光标志物，它是过渡金属与芳烃配体或基于螯合羧酸酯的配体的络合物。


16.根据权利要求15所述的基因探针，其中所述标志物是过渡金属与芳烃配体的络合物，其中所述配体选自二胺配体，如二吡啶或菲咯啉，以及三胺配体，如三联吡啶，并且所述金属是d-区过渡金属，如钌、铑、铱或锇。


17.根据权利要求16所述的基因探针，其中所述标志物是








18.根据权利要求15所述的基因探针，其中所述标志物是过渡金属与基于螯合羧酸酯的配体的络合物，其中配体是氨基聚羧酸，如EDTA或NTA或DTPA，并且所述金属是镧系金属，如铕。


19.根据以上权利要求中任一项所述的基因探针，其中所述标志物是基于过渡金属的氧化还原活性标志物，所述基于过渡金属的氧化还原活性标志物是包含一个或多个独立地选自二吡啶和菲咯啉以及三联吡啶的配体的金属络合物，其中这些二吡啶和/或菲咯啉和/或三联吡啶中的一个或多个被包含一个或多个含硫基团的连接基团官能化，所述含硫基团如硫醇基团、硫烷基团或二硫烷基团，并且其中所述金属是d-区过渡金属，如钌、铑、铱或锇。


20.根据权利要求1-18中任一项所述的基因探针，其中所述标志物是基于过渡金属的氧化还原活性标志物，其选自铁氰化物/亚铁氰化物、二茂铁和其衍生物、六氰基钌酸盐和六氰基锇酸盐。


21.根据以上权利要求中任一项所述的基因探针，其中所述标志物被连接基团官能化，其中所述连接基团包含提供末端硫原子的一个或多个基团，如硫醇基团、硫烷基团或二硫烷基团。


22.包含多种如根据权利要求1-21中任一项所定义的基因探针的组合物。


23.确定靶标核酸混合池中的靶标核酸的单核苷酸多态性(SNP)或单核苷酸修饰的百分比的方法，所述方法包括：
-将靶标核酸混合池与能够检测SNP或单核苷酸修饰的寡核苷酸探针接触，其中所述寡核苷酸探针与靶标多核苷酸...

【专利技术属性】
技术研发人员：詹姆斯·塔克，措埃·皮克拉梅诺，安德鲁·贝格斯，茹萨·纳吉，普巴尼·查克拉巴瑞特，
申请(专利权)人：伯明翰大学，
类型：发明
国别省市：英国;GB