本发明专利技术属于生物医药技术领域，公开了柠檬苦素在制备治疗/预防自身免疫性睾丸炎药物中的应用。以我国资源丰富的柑橘的核为原料，经乙醇冷浸提取得到的橘核乙醇浸膏，后经乙酸乙酯萃取后浓缩，再经硅胶柱层析，用环己烷：丙酮梯度洗脱，其中粗分段Fr6再经硅胶柱层析，用环己烷：丙酮梯度洗脱得粉末状白色固体，经重结晶得白色针状结晶即为柠檬苦素。本发明专利技术涉及的柠檬苦素的制备过程简单，操作方便，所得样品量大且易得。经药理实验表明，柠檬苦素通过降低炎症因子（IL‑1β、IL‑6和TNF‑α等），提高雄性激素睾酮（T）含量来保护自身免疫性睾丸炎症性损伤，具有抗自身免疫性睾丸炎作用，可开发成治疗/预防自身免疫性睾丸炎药物。
Application of limonoids in the preparation of drugs for the prevention and treatment of autoimmune orchitis
【技术实现步骤摘要】
柠檬苦素在制备治疗预防自身免疫性睾丸炎药物中的应用
本专利技术属于生物医药
，具体涉及柠檬苦素在制备自身免疫性睾丸炎药物中的应用。
技术介绍
据世界卫生组织（WHO）推荐，夫妇婚后同居1年以上，性生活规律而未采取任何避孕措施，由于男方原因造成女方不孕者，称为男性不育，其已成为全球性的医学和社会问题。据WHO统计，全世界约有15%的育龄夫妇罹患不育症，其中由男性因素所致的不育约占50%。我国的不育问题日益凸显，从国家统计局和国家卫健委等官方数据分析，我国2018年新生人口比2017年减少200万人，2017年又比2016年减少63万，与出生率下降相比，试管婴儿却在逐年增加。另据2012年中国人口协会和原国家计生委联名发布的《中国不孕不育现状调研报告》显示，中国育龄人口的不孕不育率从20年前的2.5%-3%攀升到12.5%-15%，患者人数已经超过5000万，其中有一定比例由男方因素造成。自身免疫性睾丸炎（autoimmuneorchitis，AO）是导致男性不育的常见原因之一。微生物感染、组织损伤、隐睾、输精管结扎或切除等都可引起AO，睾丸中激活的炎症细胞分泌高水平的细胞因子，一方面直接诱导生精细胞凋亡，另一方面破坏由支持细胞（Sertolicell，SC）形成的血-睾屏障（Blood-testisbarrier，BTB），产生抗精子抗体（anti-spermantibody，AsAb），AsAb可加重局部炎症反应，降低精子数量和活力，并使精子形态异常，阻碍精子发生，干扰精子获能，从而导致不育。此外，高水平的细胞因子还会抑制睾丸间质中的Leydig细胞合成雄性激素（睾酮），阻碍睾酮的主要生理作用之一即精子发生。对于属于慢性炎症的AO的治疗，目前尚无理想的治疗药物，现代医学多用免疫抑制剂，如地塞米松、泼尼松、强的松等进行治疗，但免疫抑制剂长期、大剂量服用会对男性生殖功能等产生不良反应，中医药在治疗AO方面有自己优势，还应结合中医药进行治疗。橘核，又名橘米、橘仁等，为芸香科(Rutaceae)柑橘属(CitrusL.)植物柑橘(CitrusreticulataBlanco)及其栽培变种的干燥成熟种子。我国柑橘资源丰富，全国19个省（区、市）有栽培，主产于湖南、浙江、福建、四川、重庆、广东、广西等10个省（区、市）。柑橘是我国栽培面积和产量最大的水果。据国家统计局数据显示，近年我国柑橘总面积及总产量分别从2011年的2077.21千公顷和2864.1万吨增加到2017年的2435.73千公顷和4138.1万吨，位居全球之冠，我国被誉为“世界柑橘资源库”。橘核，味苦，性温，入肝、肾二经。2015版《中国药典》(一部)记载其具有理气，散结，止痛的功效，用于治疗疝气疼痛，睾丸肿痛，乳痈乳癖。橘核传统上用于治疗疝气、睾丸肿痛，但目前未见橘核抗AO的现代药理学研究报道，其活性部位尚不明确，其发挥药效的化学成分还不清。我们在研究中发现橘核中含量最大的柠檬苦素具有良好的抗AO作用。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供柠檬苦素在制备治疗/预防自身免疫性睾丸炎药物中的应用。本专利技术的目的是这样实现的，柠檬苦素的结构式为：。柠檬苦素通过降低炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α，提高雄性激素T含量来治疗/预防自身免疫性睾丸炎。柠檬苦素的制备方法为：（1）乙醇提取：橘核干燥样品粉碎，用质量浓度为80-95%的乙醇冷浸提取3-6次，每次用量为橘核干燥样品的质量体积（kg/L）5-15倍，每次2-10天。减压浓缩提取液至无醇味得乙醇浸膏（A）；（2）萃取分离：将乙醇浸膏（A）加水混悬，用乙酸乙酯萃取3-6次，萃取液浓缩蒸干得乙酸乙酯萃取部位（B）；（3）粗分段：将乙酸乙酯萃取部位（B）过硅胶柱层析，用环己烷：丙酮=100:0-0:100进行梯度洗脱，收集得到粗分段Fr6；（4）分离精制：将Fr6过硅胶柱层析，用环己烷：丙酮=30:1-0:100进行梯度洗脱得粉末状白色固体，经重结晶得白色针状结晶即为柠檬苦素。步骤（1）中所述的乙醇质量浓度为80-90%，冷浸提取3-6次，每次1-7天；步骤（2）中所述的混悬用水用量为乙醇浸膏（A）的1-3倍，每次萃取时，乙酸乙酯用量为的水相体积（L）的1/6-1/2。柠檬苦素的剂量为每日1-3次，每次45.92mg-551.04mg。柠檬苦素的最优剂量为每日3次，每次91.84mg。柠檬苦素中加入药学上可接受的辅料制备成片剂、硬胶囊、软胶囊、散剂、丸剂、颗粒剂。柠檬苦素作为活性成分或者是药用载体。本专利技术优点：本专利技术的优点和积极效果在于，通过生物学研究发现，柠檬苦素通过降低IL-1β、IL-6和TNF-α等炎症因子，提高雄性激素T含量来保护小鼠实验性自身免疫性睾丸炎（EAO）损伤的。本专利技术涉及的柠檬苦素的制备过程简单，操作方便，所得样品量大且易得。柠檬苦素具有开发新的抗自身免疫性睾丸炎药物的前景，有利于提高橘核的利用价值。附图说明图1为柠檬苦素的化学结构；图2为柠檬苦素的1H-NMR谱；图3为柠檬苦素的13C-NMR（DEPT）谱；图4为橘核中柠檬苦素对EAO小鼠睾丸组织的改善作用；A:空白组；B:模型组；C:阳性药组（地塞米松组）；DH、M、L:柠檬苦素高、中、低剂量组；图5为柠檬苦素对EAO小鼠睾丸组织的改善作用切片评分；图6为柠檬苦素对EAO小鼠血清炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α及T的影响。具体实施方式本专利技术提供了柠檬苦素在制备治疗/预防自身免疫性睾丸炎药物中的应用。柠檬苦素的结构式为：。柠檬苦素通过降低炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α，提高雄性激素T含量来治疗/预防自身免疫性睾丸炎。柠檬苦素的制备方法为：（1）乙醇提取：橘核干燥样品粉碎，用质量浓度为80-95%的乙醇冷浸提取3-6次，每次用量为橘核干燥样品的质量体积（kg/L）5-15倍，每次2-10天。减压浓缩提取液至无醇味得乙醇浸膏（A）；（2）萃取分离：将乙醇浸膏（A）加水混悬，用乙酸乙酯萃取3-6次，萃取液浓缩蒸干得乙酸乙酯萃取部位（B）；（3）粗分段：将乙酸乙酯萃取部位（B）过硅胶柱层析，用环己烷：丙酮=100:0-0:100进行梯度洗脱，收集得到粗分段Fr6；（4）分离精制：将Fr6过硅胶柱层析，用环己烷：丙酮=30:1-0:100进行梯度洗脱得粉末状白色固体，经重结晶得白色针状结晶即为柠檬苦素。步骤（1）中所述的乙醇质量浓度为80-90%，冷浸提取3-6次，每次1-7天；步骤（2）中所述的混悬用水用量为乙醇浸膏（A）的1-3倍，每次萃取时，乙酸乙酯用量为的水相体积（L）的1/6-1/2。柠檬苦素的剂量为每日1-3次，每次45.92mg-551.04mg。柠檬苦素的最优剂量为每日3次，每次91.84mg。...
【技术保护点】
1.柠檬苦素在制备治疗/预防自身免疫性睾丸炎药物中的应用，其特征在于所述的柠檬苦素的结构式为：/n
【技术特征摘要】
1.柠檬苦素在制备治疗/预防自身免疫性睾丸炎药物中的应用，其特征在于所述的柠檬苦素的结构式为：
。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于柠檬苦素通过降低炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α，提高雄性激素T含量来治疗/预防自身免疫性睾丸炎。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述的柠檬苦素的制备方法为：
（1）乙醇提取：橘核干燥样品粉碎，用质量浓度为80-95%的乙醇冷浸提取3-6次，每次用量为橘核干燥样品的质量体积（kg/L）5-15倍，每次2-10天，减压浓缩提取液至无醇味得乙醇浸膏（A）；
（2）萃取分离：将乙醇浸膏（A）加水混悬，用乙酸乙酯萃取3-6次，萃取液浓缩蒸干得乙酸乙酯萃取部位（B）；
（3）粗分段：将乙酸乙酯萃取部位（B）过硅胶柱层析，用环己烷：丙酮=100:0-0:100进行梯度洗脱，收集得到粗分段Fr6；
（4）分离精制：将Fr6过硅胶柱层析，用环己烷：丙...
【专利技术属性】
技术研发人员：董发武，何红平，任嘉佳，李芳，吴石丽，杨玉林，李文洁，
申请(专利权)人：云南中医药大学，
类型：发明
国别省市：云南;53
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