一种预测甲氨蝶呤药效的肽段组合物及其定量检测方法与检测试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种预测甲氨蝶呤药效的肽段组合物及其定量检测方法与检测试剂盒，所述肽段组合物包括用于RFC蛋白表达量定量检测的第一肽段、用于FPGS蛋白表达量定量检测的第二肽段、用于GGH蛋白表达量定量检测的第三肽段、用于BCRP蛋白表达量定量检测的第四肽段和用于P‑gp蛋白表达量定量检测的第五肽段，所述第一肽段、第二肽段、第三肽段、第四肽段和第五肽段的氨基酸序列依次如Seq ID No.1至Seq ID No.5所示。本发明专利技术方案的特征性肽段，特征性强、质谱特性和酶解特性好，准确性高且稳定性强。

A peptide composition for predicting the efficacy of methotrexate and its quantitative detection method and kit

【技术实现步骤摘要】
一种预测甲氨蝶呤药效的肽段组合物及其定量检测方法与检测试剂盒
本专利技术涉及生物医药
，具体涉及一种预测甲氨蝶呤药效的肽段组合物及其定量检测方法与检测试剂盒。
技术介绍
大多数药物通过与器官、组织、细胞上的靶点作用，影响和改变人体的功能，产生药理效应(简称“药效”)。药物与机体生物大分子的结合部位即药物靶点，大多数的药物靶点在细胞内部，药物从血液进入细胞，在细胞中发挥药理作用，整个过程主要受转运蛋白、代谢酶和外排蛋白等功能蛋白的主导。功能蛋白表达情况的不同，是造成药物代谢过程和药效发挥过程差异的主要原因。甲氨蝶呤(Methotrexate，MTX)可通过内流转运体-还原型叶酸载体(reducedfolatecarrierRFC)进入细胞，然后在叶酰多聚谷氨合成酶(Folypolyglutamatesyn-thetase，FPGS)的作用下生成多聚谷氨酸甲氨蝶呤(Methotrexatepolyglutamate，MTX-PGs)，MTX-PGs在谷氨酰水解酶(Gamma-glutamylhydrolase，GGH)的作用下又可还原生成MTX，最后经外排转运体P糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)和乳腺癌耐药蛋白(breastcancerresistanceprotein，BCRP)排出细胞外。研究发现，在使用MTX治疗类风湿性关节炎时，RFC的表达量与MTX的疗效具有极强的相关性。又由于MTX-PGs自身无法出胞，易在胞内蓄积，因此，MTX的细胞毒作用主要由细胞内MTX-PGs的浓度水平决定。而长期用药会导致P-gp和BCRP过量表达，导致细胞对药物外排作用的增加，降低靶细胞内药物浓度，使得疗效降低，进而产生耐药效应。而且中国人群中不同个体间P-gp等外排转运体的表达量相差5倍以上。由此可见，在MTX作用于靶细胞的过程中，RFC、FPGS、GGH、P-gp和BCRP五种蛋白对其药效的发挥具有重要的影响。因此，在个体化给药过程中，有必要对靶细胞关键蛋白进行监测，基于RFC、FPGS、GGH、P-gp和BCRP的表达，反应MTX的药物代谢和药效发挥，对于临床个体化给药具有重要意义。与小分子药物不同，蛋白质药物大多是来源于生物体内的活性物质，与内源性物质的结构极为类似，给蛋白质药物的定量分析带来了极大的困难。目前，经典的蛋白质定量主要运用的是传统的配体结合测定方法(Ligand-bindingassays，LBA)，其中以酶联免疫法(Enzyme-LinkedImmunoSorbentAssay，ELISA)为代表，该方法具有一定的缺点，如：1)自选商场建立时间长，LBA方法开发的步骤包括关键试剂的优化、内源性干扰物质的检查、不同来源样品的交叉验证。建立LBA法需要开发关键试剂，要耗费大量的时间，通常需要6-12个月，而且耗费成本较高。2)易受内源性抗体的干扰且定量范围窄，LBA的关键试剂都是通过生物过程产生的，容易受到蛋白质翻译后修饰等因素的干扰，而且LBA方法难以使用内标来纠正定量偏差，很难保持较高的批间/实验室间的一致性。3)非特异性结合以及交叉免疫等问题严重，LBA法很难应用在不同的基质(血浆或组织)以及不同的物种之间。不同的基质成分引起的干扰和交叉反应非常明显，对LBA的特异性有很大的影响。4)样本量要求大且分析速度慢，LBA方法则很难一次性分析多种蛋白质，且每次分析所需样本量大。因此，目前临床上还未能通过同时监测RFC、FPGS、GGH、P-gp和BCRP五种蛋白表达水平进而指导MTX临床应用，开发一种能够对RFC、FPGS、GGH、P-gp和BCRP五种蛋白表达水平进行准确定量的方案迫在眉捷。高效液相色谱-串联质谱(Highperformanceliquidchromatographytandemmassspectrometry，HPLC-MS/MS)分析方法在蛋白药物定量分析中，具有良好的选择性、准确性、精确性、定量范围宽、开发时间短(约几周时间)、分析通量高以及多重分析能力的优点。若能通过HPLC-MS/MS对RFC、FPGS、GGH、P-gp和BCRP同时进行定量分析，将有望解决上述问题。
技术实现思路
本专利技术旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本专利技术提出一种预测甲氨蝶呤药效的肽段组合物，能够用于对RFC、FPGS、GGH、P-gp和BCRP五种蛋白表达水平进行准确定量。本专利技术还提出一种上述肽段组合物的定量检测方法。本专利技术还提出用于检测上述肽段组合物的检测试剂盒。根据本专利技术的第一方面实施例的肽段组合物，包括用于RFC蛋白表达量定量检测的第一肽段、用于FPGS蛋白表达量定量检测的第二肽段、用于GGH蛋白表达量定量检测的第三肽段、用于BCRP蛋白表达量定量检测的第四肽段和用于P-gp蛋白表达量定量检测的第五肽段，所述第一肽段、第二肽段、第三肽段、第四肽段和第五肽段的氨基酸序列依次如SeqIDNo.1至SeqIDNo.5所示。根据本专利技术实施例的肽段组合物，至少具有如下有益效果：本专利技术方案特征肽段能够准确表征RFC、FPGS、GGH、P-gp和BCRP五种蛋白，可满足高效液相色谱法过程中同时、高效、灵敏和准确地对五种蛋白的绝对定量化检测，以实现对MTX药效的精准预测；本专利技术方案的特征性肽段，特征性强、质谱特性和酶解特性好，准确性高且稳定性强。根据本专利技术的第二方面实施例的定量检测方法，包括以下步骤：取待测样本进行前处理，得到样本溶液，通过液相色谱-质谱联用法或定量肽段联体法(Quantificationconcatamers，QconCAT)对样本溶液中的用于RFC蛋白表达量定量检测的第一肽段、用于FPGS蛋白表达量定量检测的第二肽段、用于GGH蛋白表达量定量检测的第三肽段、用于BCRP蛋白表达量定量检测的第四肽段和用于P-gp蛋白表达量定量检测的第五肽段，进行定量检测，进而实现对RFC、FPGS、GGH、P-gp和BCRP五种蛋白表达量的定量检测，所述第一肽段、第二肽段、第三肽段、第四肽段和第五肽段的氨基酸序列依次如SeqIDNo.1至SeqIDNo.5所示。根据本专利技术实施例的定量检测方法，至少具有如下有益效果：通过对本专利技术方案特征性肽段进行定量分析，特征性强，选择性好，定量范围宽，灵敏度高，定量下限可达0.09ng·mL-1；本专利技术方案的定量检测方法，重现性好，不同批次间及实验室间的分析结果可比较性强。根据本专利技术的一些实施例，通过液相色谱-质谱联用法进行定量检测时，包括以下步骤：S1、酶解处理待测目标的蛋白样本，制成待测样品供试液；S2、通过液相色谱-质谱联用仪对所述肽段组合物进行检测及定量分析。通过液质联用对蛋白进行定量检测，可一次性实现对同一样本中的五种蛋白同时进行定量分析，所需样品量少、耗时短，快速高效，开发时间短(约2～3周即可完成开发)、分析通量高且具有多重分析能力。根据本专利技术的一些实施例，在进行定量分析前还包括以下步骤：取所述肽段组合物的标准本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种预测甲氨蝶呤药效的肽段组合物，其特征在于：包括用于RFC蛋白表达量定量检测的第一肽段、用于FPGS蛋白表达量定量检测的第二肽段、用于GGH蛋白表达量定量检测的第三肽段、用于BCRP蛋白表达量定量检测的第四肽段和用于P-gp蛋白表达量定量检测的第五肽段，所述第一肽段、第二肽段、第三肽段、第四肽段和第五肽段的氨基酸序列依次如SeqID No.1至Seq ID No.5所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种预测甲氨蝶呤药效的肽段组合物，其特征在于：包括用于RFC蛋白表达量定量检测的第一肽段、用于FPGS蛋白表达量定量检测的第二肽段、用于GGH蛋白表达量定量检测的第三肽段、用于BCRP蛋白表达量定量检测的第四肽段和用于P-gp蛋白表达量定量检测的第五肽段，所述第一肽段、第二肽段、第三肽段、第四肽段和第五肽段的氨基酸序列依次如SeqIDNo.1至SeqIDNo.5所示。


2.一种如权利要求1所述的预测甲氨蝶呤药效的肽段组合物的定量检测方法，其特征在于：包括以下步骤：
取待测样本进行前处理，得到样本溶液，通过液相色谱-质谱联用法或QconCAT对样本溶液中的第一肽段、第二肽段、第三肽段、第四肽段和第五肽段，进行定量检测，进而实现对RFC、FPGS、GGH、P-gp和BCRP五种蛋白表达量的定量检测。


3.根据权利要求2所述的定量检测方法，其特征在于：通过液相色谱-质谱联用法进行定量检测时，包括以下步骤：
S1、酶解处理待测目标的蛋白样本，制成待测样品供试液；
S2、通过液相色谱-质谱联用仪对所述肽段组合物进行检测及定量分析。


4.根据权利要求3所述的定量检测方法，其特征在于：通过在待测样品供试液中加入以下序列结构的同位素肽段对所述肽段组合物中的各肽段进行定量分析：RFC：AAQAL(13C,15N)SVQDK；FPGS：SGL(13C,15N)QVEDLDR；GGH：YLESAGAR(1...

【专利技术属性】
技术研发人员：余鹏，江寒冰，张可，丁尧，
申请(专利权)人：中南大学，
类型：发明
国别省市：湖南;43