一种基于琼脂糖的外泌体富集微流控芯片及制备方法技术

本发明专利技术提供了一种基于琼脂糖的外泌体富集微流控芯片及制备方法，属于外泌体富集平台技术领域。包括基底和琼脂糖层，琼脂糖层贴合在基底表面；琼脂糖层内设置有叉型微通道结构，叉型微通道结构含有斜流通道、汇集通道和分离通道，分离通道用于将含有外泌体的样液中的外泌体通过斜流通道富集到汇集通道中，并用于将样液中的杂质分子从琼脂糖凝胶的孔隙中排出。制备方法为将阳膜的结构复制到琼脂糖上，得到含有所述叉型微通道结构的琼脂糖层；将琼脂糖层贴合在基底上，然后在琼脂糖层上打孔，用作进样口，即得到基于琼脂糖的外泌体富集微流控芯片。本发明专利技术可以实现外泌体的快速富集及高效检测，具有操作方便，高效，以及成本低等特点。

A microfluidic chip based on agarose for exosomes enrichment and its preparation

【技术实现步骤摘要】
一种基于琼脂糖的外泌体富集微流控芯片及制备方法
本专利技术属于外泌体富集平台
，特别提供了一种基于琼脂糖的外泌体富集微流控芯片及制备方法。
技术介绍
外泌体作为细胞外囊泡(EV)的一个重要亚群，其自身及其相关蛋白和核酸已被广泛认为是无创诊断和预后肿瘤生物标志物。外泌体分析目前主要存在两大挑战：一、如何从复杂的细胞基质或体液中分离得到外泌体；二、外泌体直径比细胞小100倍，体积比细胞小1000000倍，且具有高度异质性，如何操控并精准分析。当前，外泌体分离的主流方法是超速离心(差速或密度梯度等)，被认为外泌体分离的“金标准”。但该技术存在明显的缺陷：1、通过高速离心获得的外泌体在形态上容易畸变；2、方法非常耗时，需要20-30小时；3、分离的纯度不高，获得的外泌体夹杂着大量其他微泡。为解决分离问题，最近发展起来的基于外泌体表面特异标志蛋白的免疫亲和方法，如亲和色谱、免疫磁珠或者试剂盒纯化方法，能实现外泌体的快速特异性分离。外泌体分析目前主要还是沿用已有的细胞分析方法。破环性分析，亦即：类似细胞分析一样，将大量外泌体裂解后定性定量分析其组份，需要大量外泌体的样本，但从动物或人的体液中很难获取大量的外泌体，同时此法难以获取原位外泌体完整信息，特别是获取外泌体相关RNA信息。类似细胞分析，成像也是外泌体分析的主要方法，但由于外泌体太小，如何标记并操控、如何提高分辨率等，也是当前面临的全新挑战。研究揭示，当外泌体的癌症筛查指标浓度较低时，单纯外泌体分离后直接检测往往还不能奏效。外泌体预浓缩后再进行检测将是一个不错的选择。基于微流控芯片外泌体在线浓缩或富集的研究目前还比较少，例如Marczak和同事们借助离子浓差极化初步实现外泌体的在线浓缩(Electrophoresis,Feb27,2018,392029-2038)64，但也仅仅是浓缩并未进一步在线检测。最近，国内孙佳姝课题组则报道了一种热泳适配体集成化芯片，用于特异性外泌体的富集检测，并成功实现了多种癌症血清样品分类和检测，有望实现癌症的早期筛查(NatBiomedEng,Mar,2019,3(3):183-193)。此方法虽简单有效，但仍需要复杂外围设备辅助。除了检测外泌体表面特异蛋白，外泌体内蛋白或核酸等，比如microRNAs(miRNAs)也可作为预测和早期诊断癌症转移的替代分子生物标志物。最近的研究表明，miRNA在各种类型的癌细胞(包括乳腺癌细胞)分泌的外泌体中均有表达。有趣的是，大量的实验证据揭示，当miRNA包裹在外泌体中时，比游离RNA更稳定，这为封装在外泌体内的miRNA的检测提供了一种很有前景的方法。最近，Lee等人利用分子信标首次对外泌体多个内部特异核酸进行了原位完整检测，相较于传统的定量PCR破坏性分析，此方法不仅快速方便，同时能保持外泌体的完整性，便于进一步下游分析。但其借助96孔板检测，并无富集步骤，样品消耗量大，且未进行信号放大检测，灵敏度较低。纵观现有方法，由于技术限制，大部分只实现了外泌体的高效分离和裂解释放，并未实现外泌体超敏检测(信号放大)；其二对外泌体的分析大多是破坏性分析，即：将获得的外泌体裂解后进行后续WesternBlot(WB)分析蛋白质或定量PCR分析RNA等，并非原位直接检测；其三，外泌体富集并原位双检测(外泌体数量以及内部特异核酸分子的同时检测)仍面临巨大挑战。此外，虽有研究表明病人体液中的外泌体数量比正常人显著增大，其特异标记物水平也比正常人显著升高。但如何区分特异标记物水平升高是由于外泌体数量增大(特异标记物表达水平一致)还是由于特异标记物在外泌体上高特异性富集或高表达(外泌体数量变化不大)造成的，目前也面临巨大挑战。
技术实现思路
本专利技术解决了现有技术中外泌体富集效率低，检测背景高，以及难以实现外泌体的多种标记物(如特异标记物和非特异标记物)同时检测等技术问题，提供了基于琼脂糖的外泌体富集微流控芯片，琼脂糖层内设置有叉型微通道结构，叉型微通道结构含有斜流通道、汇集通道和多个并行排列的分离通道，多个并行排列的分离通道的末端与斜流通道连接，斜流通道的末端与汇集通道连接，斜流通道与汇集通道呈Y型分布；多个并行排列的分离通道用于将含有外泌体的样液中的外泌体通过斜流通道富集到汇集通道中，并用于将样液中的分子从琼脂糖凝胶的孔隙中排出。本专利技术中的芯片，能有效除去游离的探针，有效降低背景，实现了外泌体高效富集。按照本专利技术的第一方面，提供了一种基于琼脂糖的外泌体富集微流控芯片，包括基底和琼脂糖层，所述琼脂糖层贴合在所述基底表面；所述琼脂糖层内设置有叉型微通道结构，所述叉型微通道结构含有斜流通道、汇集通道和多个并行排列的分离通道，所述多个并行排列的分离通道的末端与斜流通道连接，所述斜流通道的末端与汇集通道连接，所述斜流通道与汇集通道呈Y型分布；所述琼脂糖层上表面具有孔洞，所述孔洞用作进样口，用于将含有外泌体的样液流经叉型微通道结构的各个分离通道中；所述多个并行排列的分离通道用于将含有外泌体的样液中的外泌体通过斜流通道富集到汇集通道中，并用于将样液中的杂质分子从琼脂糖凝胶的孔隙中排出。优选地，所述各个分离通道的宽度为1-100μm，高度为1-100μm。优选地，所述斜流通道呈对称分布，各个所述斜流通道宽度逐渐增大，与汇集通道连接处的宽度最大。按照本专利技术的另一方面，提供了任一所述的基于琼脂糖的外泌体富集微流控芯片的制备方法，包括以下步骤：S1：制备阳膜，所述阳膜具有并行排列的凹槽和柄端，所述凹槽的末端与斜侧部连接，所述斜侧部与柄端连接；将琼脂糖粉末加热溶解在水溶液中，然后将琼脂糖溶液浇筑于所述阳膜上，冷却固化后，将固化后的琼脂糖揭起，得到含有叉型微通道结构的琼脂糖层；所述阳膜上的凹槽之间的部分对应形成叉型微通道结构的各个分离通道，所述阳膜上的柄端对应形成叉型微通道结构的汇集通道，所述斜侧部对应形成叉型微通道结构的斜流通道；S2：在步骤S1中得到的琼脂糖层上打孔，所述孔用作进样口，用于将含有外泌体的样液流经叉型微通道结构的各个分离通道中，然后将琼脂糖层贴合在基底上，即得到基于琼脂糖的外泌体富集微流控芯片。优选地，通过光刻方法或者3D打印方法制备所述阳膜。优选地，通过光刻方法制备所述阳膜的方法具体为：将SU-8胶甩于洗净烘干的硅片上，前烘除去SU-8胶中的溶剂之后，进行光刻，然后进行后烘，之后经显影液显影后，再进行坚膜，即可得到具有所述叉型微通道结构阳膜。优选地，所述琼脂糖溶液的质量浓度为3％-10％。优选地，步骤S2中所述贴合步骤后，包括抽真空的步骤，用于除去琼脂糖层中叉型微通道结构中的气泡和琼脂糖层与基底之间的气泡。优选地，所述基底为亲水性基底。优选地，所述基底为玻璃。总体而言，本专利技术所构思的以上技术方案与现有技术相比，主要具备以下的技术优点：(1)本专利技术提供了一种基于叉型结构及琼脂糖材质被动式毛细力进样方式，无需外设进样设备(比如泵或阀)，简单方便，成本低。(2)本专利技术借助琼脂糖的高亲水性及毛细作用力以及封闭末本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于琼脂糖的外泌体富集微流控芯片，其特征在于，包括基底(1)和琼脂糖层(2)，所述琼脂糖层(2)贴合在所述基底(1)表面；所述琼脂糖层内设置有叉型微通道结构，所述叉型微通道结构含有斜流通道(3)、汇集通道(4)和多个并行排列的分离通道(5)，所述多个并行排列的分离通道(5)的末端与斜流通道(3)连接，所述斜流通道(3)的末端与汇集通道(4)连接，所述斜流通道(3)与汇集通道(4)呈Y型分布；所述琼脂糖层(2)上表面具有孔洞，所述孔洞用作进样口，用于将含有外泌体的样液流经叉型微通道结构的各个分离通道(5)中；所述多个并行排列的分离通道(5)用于将含有外泌体的样液中的外泌体通过斜流通道(3)富集到汇集通道(4)中，并用于将样液中的杂质分子从琼脂糖凝胶的孔隙中排出。/n

【技术特征摘要】
1.一种基于琼脂糖的外泌体富集微流控芯片，其特征在于，包括基底(1)和琼脂糖层(2)，所述琼脂糖层(2)贴合在所述基底(1)表面；所述琼脂糖层内设置有叉型微通道结构，所述叉型微通道结构含有斜流通道(3)、汇集通道(4)和多个并行排列的分离通道(5)，所述多个并行排列的分离通道(5)的末端与斜流通道(3)连接，所述斜流通道(3)的末端与汇集通道(4)连接，所述斜流通道(3)与汇集通道(4)呈Y型分布；所述琼脂糖层(2)上表面具有孔洞，所述孔洞用作进样口，用于将含有外泌体的样液流经叉型微通道结构的各个分离通道(5)中；所述多个并行排列的分离通道(5)用于将含有外泌体的样液中的外泌体通过斜流通道(3)富集到汇集通道(4)中，并用于将样液中的杂质分子从琼脂糖凝胶的孔隙中排出。


2.如权利要求1所述的基于琼脂糖的外泌体富集微流控芯片，其特征在于，所述各个分离通道(5)的宽度为1-100μm，高度为1-100μm。


3.如权利要求1所述的基于琼脂糖的外泌体富集微流控芯片，其特征在于，所述斜流通道(3)呈对称分布，各个所述斜流通道(3)宽度逐渐增大，与汇集通道(4)连接处的宽度最大。


4.如权利要求1-3任一所述的基于琼脂糖的外泌体富集微流控芯片的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：制备阳膜，所述阳膜具有并行排列的凹槽和柄端，所述凹槽的末端与斜侧部连接，所述斜侧部与柄端连接；将琼脂糖粉末加热溶解在水溶液中，然后将琼脂糖溶液浇筑于所述阳膜上，冷却固化后，将固化后的琼脂糖揭起，得到含有叉型微通道结构的琼脂糖层...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘笔锋，陈鹏，
申请(专利权)人：华中科技大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42