一种“金蚕花”抗癌活性核苷类化合物JCHN2的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种“金蚕花”抗癌活性核苷类化合物JCHN2的制备方法。蝉拟青霉感染家蚕蛹培育“金蚕花”并处理得“金蚕花”粉，加入乙醇溶液超声，再水浴回流和抽滤处理，离心收集上清液，浓缩后冷冻干燥；双蒸馏水溶解，离心取上清液，过滤膜后上大孔吸附树脂柱吸附，乙醇溶液洗脱后取洗脱峰的洗脱液，浓缩并冷冻干燥；双蒸馏水溶解，离心取上清液，过滤膜后上阳离子交换柱，NaCl水溶液梯度洗脱，取中间洗脱峰的洗脱液，用大孔吸附树脂柱脱盐，浓缩并冷冻干燥后得到均一核苷类化合物JCHN2。本发明专利技术制备产物纯度均一，对人胃癌细胞和人胃腺癌细胞生长均有明显抑制作用，对正常人胚胎肾细胞生长无不良影响，用于抗癌产品开发。

Preparation of jchn2, a nucleoside compound with anticancer activity

【技术实现步骤摘要】
一种“金蚕花”抗癌活性核苷类化合物JCHN2的制备方法
本专利技术涉及了一种抗癌活性新化合物及制备方法，尤其是涉及了一种“金蚕花”抗癌活性核苷类化合物JCHN2的制备方法。
技术介绍
核苷类化合物是生物细胞维持生命活动的基本物质，包括核苷、碱基及核苷类似物，具有抗病毒、抗氧化、抗菌、抗疲劳、提高人体免疫力、抗癌等生理活性，现已被广泛应用于抗癌、抗病毒、疾病诊断等方面。目前用于临床和正在研究的核苷类抗癌药物有数十种，它们主要是通过干扰癌细胞的DNA合成或者核酸转录的过程，来抑制蛋白质的合成，从而达到治疗癌症的效果。当前核苷类抗癌药物主要来源于化学合成和从天然中药材中提取分离这二个方面，化学合成存在步骤复杂、异构体不好分离、转化率低、成本高、污染环境等问题，而作为天然中药材基础类物质之一的核苷类化合物可以直接或间接作为药物使用并在抗癌方面展示出了不可取代的独特作用，深受国内外研究者的高度关注。蝉花(Cordycepscicadae)为麦角菌科真菌大蝉草的无性型蝉拟青霉寄生蝉类若虫体后所产生的子座与若虫尸体的菌虫复合体，又名蝉草、蝉茸、胡蝉、金蝉花等，是我国一味传统的名贵中药材。有关蝉花的记载最早出现在公元前五世纪的南北朝时期《雷公炮炙论》中“凡使，要白花全者，收得后于屋下东角悬干，去甲土后，用浆水煮一日，至夜，焙干，碾细用之”，后在隋、唐代甄权的《药性论》、宋代苏颂的《图经本草》、明代李时珍的《本草纲目》等中药古籍均对蝉花的药用作了详细记载。蝉花具有疏风散热、定惊镇静等功效，在古方中主要用来治疗小儿夜啼、惊厥、风痰潮热等症状，在现方剂中多用来治疗慢性肾病、咳嗽以及抗癌、滋补强身等。由于自然界中野生蝉花资源日趋枯竭,人工培养蝉花越来越显得必要。家蚕(Bombyxmori)起源于我国，可大规模室内饲养，资源非常丰富，同时家蚕是传统的药食同源的宝贵资源，不仅营养与药用价值高，而且安全以及外观形态与蝉相似。为此，将蝉拟青霉ST168感染蚕蛹人工培养“金蚕花”，并分离纯化制备“金蚕花”抗癌活性核苷类化合物，对于推进“金蚕花”作为蝉花代用品的开发应用以及提升蚕桑产业，均具有积极的现实意义。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种“金蚕花”抗癌活性核苷类化合物JCHN2的制备方法，是采用人工培养、回流提取、NKA-Ⅱ型大孔吸附树脂柱分离、SP-SepharoseFastFlow阳离子交换柱纯化的方法，制备“金蚕花”抗癌活性核苷类化合物JCHN2。为了达到上述目的，本专利技术采用的技术方案如下：一、一种“金蚕花”抗癌活性核苷类化合物JCHN2的制备方法：1)将蝉拟青霉ST168感染家蚕蛹，培育出“金蚕花”；2)将“金蚕花”处理获得“金蚕花”粉；3)取“金蚕花”粉加入乙醇溶液并进行超声处理；4)超声处理后的溶液依次进行水浴回流和抽滤处理，然后离心处理收集上清液；5)上清液浓缩后冷冻干燥，得到粗核苷类化合物；6)用双蒸馏水将粗核苷类化合物溶解，离心取上清液后，过滤膜再上NKA-Ⅱ型大孔吸附树脂柱吸附处理；7)用乙醇溶液洗脱后收集洗脱峰的洗脱液，浓缩并冷冻干燥后得到核苷类化合物干燥物；8)用双蒸馏水将核苷类化合物干燥物溶解，离心取上清液后，过滤膜再上SP-SepharoseFastFlow阳离子交换柱，用NaCl水溶液进行梯度洗脱，收集0.3mol/LNaCl洗脱峰的洗脱液；9)洗脱液浓缩并冷冻干燥，用双蒸馏水溶解，过滤膜再上NKA-Ⅱ型大孔吸附树脂柱脱盐；10)用乙醇溶液洗脱后收集洗脱峰的洗脱液，冷冻干燥后得到均一的核苷类化合物，取名JCHN2。方法工艺条件具体为：1)从天目山采集的野生蝉花体中分离出蝉拟青霉ST168，在马铃薯琼脂培养基上于26℃下培养7天，用0.05％吐温80水溶液洗下分生孢子并配成2-3×108个/mL分生孢子悬液；将分生孢子悬液均匀喷湿化蛹第2天的蚕蛹体表，然后至28℃下培养，待蛹体僵硬后，埋入3-4cm深土中，继续28℃下培养，待子座长出土面后收获，得到“金蚕花”；2)将“金蚕花”于-50℃下真空干燥36h，于-15℃下超微粉碎5min，过80～100目筛，得到“金蚕花”粉；3)取“金蚕花”粉，加入乙醇溶液，混匀后，在30℃下用超声波清洗仪以500W功率53KHz频率的超声波磁场作用30min；4)于100℃水浴中回流提取3次，共2.1h，集中收集三次的提取液，三次提取液经过合并后用抽滤机进行抽滤处理，弃掉滤渣，将滤液用高速离心机于10000rpm下离心5min，弃掉沉淀，收集上清液；5)上清液用旋转蒸发仪浓缩后，-50℃下真空干燥，得到粗核苷类化合物；6)用双蒸馏水溶解粗核苷类化合物并调整质量浓度为5.0～6.0mg/mL，将溶液在8000rpm下离心10min，取上清液，过0.45mm滤膜，上NKA-Ⅱ型大孔吸附树脂柱吸附，用5倍柱体积的去离子水充分冲洗；7)用质量分数为75％的乙醇溶液于2.0～3.0mL/min流速下洗脱，自动收集器收集，用紫外分光光度计于254nm波长测定，收集合并具有核苷类化合物洗脱峰的洗脱液，用旋转蒸发仪浓缩后，-50℃下真空干燥，得到核苷类化合物干燥物；8)用双蒸馏水溶解核苷类化合物干燥物并调整质量浓度为2.0～2.5mg/mL，将溶液在8000rpm下离心10min，取上清液，过0.45μm滤膜，上SP-SepharoseFastFlow阳离子交换柱，用0-0.5mol/L浓度梯度的NaCl水溶液进行梯度洗脱，洗脱流速为1.0-1.3mL/min，收集0.3mol/L浓度的NaCl水溶液对应洗脱峰的洗脱液；9)洗脱液用旋转蒸发仪浓缩后，-50℃下真空干燥，用双蒸馏水溶解干燥物并调整质量浓度为2.5～3.0mg/mL，将溶液在8000rpm下离心10min，取上清液，过0.45μm滤膜，上NKA-Ⅱ型大孔吸附树脂柱吸附，用5倍柱体积的去离子水充分冲洗；10)用质量分数为75％的乙醇溶液于2.0～3.0mL/min流速下洗脱，自动收集器收集，用紫外分光光度计于254nm波长测定，收集合并具有核苷类化合物洗脱峰的洗脱液，用旋转蒸发仪浓缩后，-50℃下真空干燥，得到均一的核苷类化合物，取名JCHN2。所述步骤3)中，按W：V为1:40配比加入“金蚕花”粉和质量分数为80％的乙醇溶液。二、由上述方法制备而成的“金蚕花”抗癌活性核苷类化合物JCHN2在抗癌和制备抗癌药物中的应用。所述抗癌中的应用是针对人胃癌细胞SGC-7901和人胃腺癌细胞AGS，具体是抑制癌细胞生长的作用。本专利技术具有的有益效果是：本专利技术分离纯化制备的“金蚕花”抗癌活性核苷类化合物JCHN2，纯度均一，对人胃癌细胞SGC-7901和人胃腺癌细胞AGS的生长均表现出明显的抑制作用，对正常细胞的人胚胎肾细胞HEK293生长无不良影响，可用于抗癌产品的开发，这对于推进“金蚕花”作为蝉花代用品的开发应用以及提升蚕桑产业，具有积本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种“金蚕花”抗癌活性核苷类化合物JCHN2的制备方法，其特征在于：/n1)将蝉拟青霉ST168感染家蚕蛹，培育出“金蚕花”；/n2)将“金蚕花”处理获得“金蚕花”粉；/n3)取“金蚕花”粉加入乙醇溶液并进行超声处理；/n4)超声处理后的溶液依次进行水浴回流和抽滤处理，然后离心处理收集上清液；/n5)上清液浓缩后冷冻干燥，得到粗核苷类化合物；/n6)用双蒸馏水将粗核苷类化合物溶解，离心取上清液后，过滤膜再上NKA-Ⅱ型大孔吸附树脂柱吸附处理；/n7)用乙醇溶液洗脱后收集洗脱峰的洗脱液，浓缩并冷冻干燥后得到核苷类化合物干燥物；/n8)用双蒸馏水将核苷类化合物干燥物溶解，离心取上清液后，过滤膜再上SP-Sepharose Fast Flow阳离子交换柱，用NaCl水溶液进行梯度洗脱，收集0.3mol/L NaCl洗脱峰的洗脱液；/n9)洗脱液浓缩并冷冻干燥，用双蒸馏水溶解，过滤膜再上NKA-Ⅱ型大孔吸附树脂柱脱盐；/n10)用乙醇溶液洗脱后收集洗脱峰的洗脱液，冷冻干燥后得到均一的核苷类化合物，取名JCHN2。/n

【技术特征摘要】
1.一种“金蚕花”抗癌活性核苷类化合物JCHN2的制备方法，其特征在于：
1)将蝉拟青霉ST168感染家蚕蛹，培育出“金蚕花”；
2)将“金蚕花”处理获得“金蚕花”粉；
3)取“金蚕花”粉加入乙醇溶液并进行超声处理；
4)超声处理后的溶液依次进行水浴回流和抽滤处理，然后离心处理收集上清液；
5)上清液浓缩后冷冻干燥，得到粗核苷类化合物；
6)用双蒸馏水将粗核苷类化合物溶解，离心取上清液后，过滤膜再上NKA-Ⅱ型大孔吸附树脂柱吸附处理；
7)用乙醇溶液洗脱后收集洗脱峰的洗脱液，浓缩并冷冻干燥后得到核苷类化合物干燥物；
8)用双蒸馏水将核苷类化合物干燥物溶解，离心取上清液后，过滤膜再上SP-SepharoseFastFlow阳离子交换柱，用NaCl水溶液进行梯度洗脱，收集0.3mol/LNaCl洗脱峰的洗脱液；
9)洗脱液浓缩并冷冻干燥，用双蒸馏水溶解，过滤膜再上NKA-Ⅱ型大孔吸附树脂柱脱盐；
10)用乙醇溶液洗脱后收集洗脱峰的洗脱液，冷冻干燥后得到均一的核苷类化合物，取名JCHN2。


2.根据权利要求1所述的一种“金蚕花”抗癌活性核苷类化合物JCHN2的制备方法，其特征在于方法的工艺条件具体为：
1)从天目山采集的野生蝉花体中分离出蝉拟青霉ST168，在马铃薯琼脂培养基上于26℃下培养7天，用0.05％吐温80水溶液洗下分生孢子并配成2-3×108个/mL分生孢子悬液；将分生孢子悬液均匀喷湿化蛹第2天的蚕蛹体表，然后至28℃下培养，待蛹体僵硬后，埋入3-4cm深土中，继续28℃下培养，待子座长出土面后收获，得到“金蚕花”；
2)将“金蚕花”于-50℃下真空干燥36h，于-15℃下超微粉碎5min，过80～100目筛，得到“金蚕花”粉；
3)取“金蚕花”粉，加入乙醇溶液，混匀后，在30℃下用超声波清洗仪以500W功率53KHz频率的超声波磁场作用30min；
4)于100℃水浴中回流提取3次，共2.1h，集中收集三次的提取液，三次提取液经过合并后用抽滤机进行抽滤处理，弃掉滤渣，将滤液用高速离心机于10000rpm下离心5min，弃掉沉淀，收集上清液；
5)上清液用旋转蒸发仪浓缩后，-50℃...

【专利技术属性】
技术研发人员：时连根，李聪慧，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33