一种采用鸡胚绒毛膜尿囊膜的抗刺激体外评价方法技术

本发明专利技术公开了一种采用鸡胚绒毛膜尿囊膜的抗刺激体外评价方法，包括以下步骤：(1)鸡胚绒毛膜尿囊膜的制备；(2)受试物浓度筛选；(3)绒毛膜尿囊膜与受试物预处理孵育反应；(4)加入刺激物进行反应；(5)刺激评分IS计算：根据受试物反应，计算刺激评分IS，如果受试物刺激评分IS为对照品的1/2或1/2以下时，认为该受试物具有潜在抗刺激效果。该方法采用鸡胚绒毛膜尿囊膜作为测试系统，可以对多种受试物进行评价，具有快速、简便、成本低的特点。

An in vitro evaluation method of anti stimulation with chorioallantoic membrane of chicken embryo

【技术实现步骤摘要】
一种采用鸡胚绒毛膜尿囊膜的抗刺激体外评价方法
本专利技术属于抗刺激试验
，具体涉及一种采用鸡胚绒毛膜尿囊膜的抗刺激体外评价方法。
技术介绍
人体皮肤和黏膜与外界接触，构成人体的第一道屏障。日常生活中，体表皮肤或黏膜，如表皮、角膜、结膜、口腔黏膜、呼吸道黏膜、消化道黏膜和阴道黏膜等常常会接触某些刺激性化学刺激物，如刺激性表面活性剂(洁面、香波或洗衣液等)、刺激性环境污染物(挥发性有机物、汽车尾气或气味香精等)、甚至农药等，造成皮肤和黏膜的刺激性反应。受所在部位和发挥功能的差异，虽然均属于上皮性结构，但对刺激物的敏感性和反应性均存在差异。。此外，由于化妆品使用的低龄化、频繁化和多样化，使得皮肤接触刺激物的机率、种类和数量都呈现增长趋势，皮肤在化合物的长期作用下，可能出现角质层变薄，对刺激反应的阈值降低、敏感性增强等现象，对原本微弱或无刺激性的物质产生如红斑、瘙痒、刺痛等感受。因此，开发抗刺激性和敏感肌适应的产品成为产品开发和消费者关注的话题。因此有必要建立一套敏感的抗刺激性测试方法，应用于个人护理品和家居护理品的开发。现有的体内体外评价技术并没有专门涉及到抗刺激的效果。一般的方法是在现有刺激性试验的基础上，提高无刺激性判定的阈值，如CAMVA方法，将3％的安全阈值提高到30％；或者增加现有检测方法的终点，如重组人皮肤模型的方法中，增加炎症因子水平。上述方法均可以显著提高产品安全性，降低刺激性风险。但是上述方法缺少刺激物的参与，并没有很好地反应出产品对刺激物的抗刺激效果，即保护、减少或免受刺激物的有害作用。<br>上皮结构的共有特点是具有屏障功能、细胞具有极性、感觉神经末梢丰富和结缔组织血管丰富。刺激性反应呈现的发红、水肿、炎症和血管共同参与的结果，通常造成皮肤或黏膜刺激性的物质也会对血管产生刺激性反应。鸡胚绒毛膜尿囊膜作为测试系统具有较高的敏感性，已广泛用于结膜刺激性、血管反应性、黏膜刺激性等方面的研究。并且该系统简单、成熟、材料来源广泛、相关性高，容易推广。但未见在抗刺激领域的研究。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供采用鸡胚绒毛膜尿囊膜的抗刺激体外评价方法，该方法采用鸡胚绒毛膜尿囊膜作为测试系统，可以对多种受试物进行评价，具有快速、简便、成本低的特点。本专利技术中的采用鸡胚绒毛膜尿囊膜的抗刺激体外评价方法，利用鸡胚绒毛膜尿囊膜的特征，在受试物接触血管膜后，通过测量鸡胚血管网对刺激物的反应程度，评价受试物质是否具有抗刺激效果。本方法具有快速、简便、成本低等优点，可以对多种受试物进行快速评价。本专利技术中采用鸡胚作为测试系统，其绒毛膜尿囊膜具有血管丰富，敏感性高等特点，根据血管反应的程度，可评价经吸收受试物的抗刺激性效果，预测受试物对人体的保护作用。本专利技术的上述目的是通过如下技术方案来实现的：一种采用鸡胚绒毛膜尿囊膜的抗刺激体外评价方法，包括以下步骤：(1)鸡胚绒毛膜尿囊膜的制备：选取鸡的种蛋，进行孵育后，选取9-13天鸡胚，标记鸡胚气室位置，去除蛋壳，暴露蛋膜，滴入预温生理盐水，继续孵化后，取出鸡蛋，剥除外膜，获得鸡胚绒毛膜尿囊膜；(2)浓度筛选：在鸡胚绒毛膜尿囊膜表面加入一系列不同浓度的受试物，孵育10分钟-24小时后，取出鸡胚，观察血管反应，选择无血管反应的受试物浓度；(3)绒毛膜尿囊膜与受试物预处理孵育反应：选择无血管反应的1-5个浓度的受试物，加入鸡胚绒毛膜尿囊膜表面，进行预处理孵育反应10分钟-24小时；(4)加入刺激物进行反应：在预处理孵育反应后的鸡胚绒毛膜尿囊膜表面加入刺激物，进行孵化反应10-60分钟，造成刺激性反应，其中所述刺激物为乳酸或十二烷基硫酸钠；(5)计算：根据受试物反应，计算刺激评分IS，其中刺激评分IS的计算通过以下公式：刺激评分IS＝[5×(301-H)+7×(301-L)+9×(301-C)]/300其中H、L和C分别为计时5分钟首次出现出血的时间、溶血的时间和凝血的时间；如果受试物刺激评分IS为对照品的1/2或1/2以下时，认为该受试物具有潜在抗刺激效果。在上述采用鸡胚绒毛膜尿囊膜的抗刺激体外评价方法中：优选的，步骤(1)中所述种蛋为育龄为0-9天的SPF级(无特定病原微生物)的白莱杭鸡(WhiteLeghornchicken)、星杂288(ShaverStarcross)、麻黄(spotted-brownchickens)、白洛克(WhitePlymouthRock)或岭南黄鸡(LingnanYellowchicken)等品种受精鸡胚。首选白莱杭鸡，经检疫后使用。收获0天种蛋后，经消毒后置于孵化箱进行孵育，孵育温度36.5±1.5℃。优选的，步骤(1)中选取9-13天鸡胚，所述鸡胚的质量为50-70克，选取存活的鸡胚，并标记鸡胚气室位置。具体的，步骤(1)中选取使用9-13天鸡胚，试验当天，使用照蛋器检查鸡胚存活情况，选取存活的鸡胚，同时标记气室位置，仅挑选50-70克鸡胚用于试验。优选的，步骤(1)中去除蛋壳，暴露蛋膜，在外膜表面滴入预温生理盐水，然后返回孵化箱10分钟。具体的，步骤(1)中去除鸡蛋外壳，在外膜上滴入少量预温生理盐水，返回孵化箱10分钟。取出鸡蛋，小心剥除外膜，检查是否损伤绒毛膜尿囊膜，选取无损伤绒毛膜尿囊膜的鸡胚。优选的，步骤(2)中所述受试物为个人护理品或家居护理品的原料、配方或产品，包括植物提取物、清洁剂、护肤品、眼部用品等，也包括皮肤和眼科药物、化学品、农药、消毒剂、医疗器械等可能接触皮肤或黏膜的物质。优选的，步骤(2)中所述一系列不同浓度的受试物的浓度范围为1-100mg/mL，所述受试物的体积为300-600微升。优选的，步骤(3)中加入鸡胚绒毛膜尿囊膜表面的受试物质的体积为300-600微升。进一步的，步骤(3)中还设置有对照品(对照组)，所述对照品(对照组)为生理盐水(NS)。优选的，步骤(4)中加入刺激物的体积为100-300微升，所述乳酸的质量百分含量为5-25％，更佳的为15％，所述十二烷基硫酸钠的质量百分含量为0.1-8％，更佳的为3％。进一步的，步骤(5)中还包括抗刺激指数H1、抗刺激指数L1和抗刺激指数C1，其中抗刺激指数H1＝H受试物/H对照品、抗刺激指数L1＝L受试物/L对照品、抗刺激指数C1＝C受试物/C对照品，其中H受试物、L受试物和C受试物是指受试物在计时5分钟首次出现出血的时间、溶血的时间和凝血的时间，H对照品、L对照品和C对照品是指对照品在计时5分钟首次出现出血的时间、溶血的时间和凝血的时间。进一步的，可根据抗刺激指数H1、抗刺激指数L1和抗刺激指数C1的数值大小来判断对刺激评分IS的贡献，抗刺激指数H1、抗刺激指数L1和抗刺激指数C1越大，对刺激评分IS的贡献越大。步骤(5)中如果受试物刺激评分IS为对照品的1/2或1/2以下时，认为该受试物具有潜在抗刺激效果，反之则不具有抗刺激效果。本专利技术具有如下有益效果：(1)本发本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种采用鸡胚绒毛膜尿囊膜的抗刺激体外评价方法，其特征是包括以下步骤：/n(1)鸡胚绒毛膜尿囊膜的制备：选取鸡的种蛋，进行孵育后，选取9-13天鸡胚，标记鸡胚气室位置，去除蛋壳，暴露蛋膜，滴入预温生理盐水，继续孵化后，取出鸡蛋，剥除外膜，获得鸡胚绒毛膜尿囊膜；/n(2)浓度筛选：在鸡胚绒毛膜尿囊膜表面加入一系列不同浓度的受试物，孵育10分钟-24小时后，取出鸡胚，观察血管反应，选择无血管反应的受试物浓度；/n(3)绒毛膜尿囊膜与受试物预处理孵育反应：选择无血管反应的1-5个浓度的受试物，加入鸡胚绒毛膜尿囊膜表面，进行预处理孵育反应10分钟-24小时；/n(4)加入刺激物进行反应：在预处理孵育反应后的鸡胚绒毛膜尿囊膜表面加入刺激物，进行孵化反应10-60分钟，造成刺激性反应，其中所述刺激物为乳酸或十二烷基硫酸钠；/n(5)计算：根据受试物反应，计算刺激评分IS，其中刺激评分IS的计算通过以下公式：/n刺激评分IS＝[5×(301-H)+7×(301-L)+9×(301-C)]/300/n其中H、L和C分别为计时5分钟首次出现出血的时间、溶血的时间和凝血的时间；/n如果受试物刺激评分IS为对照品的1/2或1/2以下时，认为该受试物具有潜在抗刺激效果。/n...

【技术特征摘要】
1.一种采用鸡胚绒毛膜尿囊膜的抗刺激体外评价方法，其特征是包括以下步骤：
(1)鸡胚绒毛膜尿囊膜的制备：选取鸡的种蛋，进行孵育后，选取9-13天鸡胚，标记鸡胚气室位置，去除蛋壳，暴露蛋膜，滴入预温生理盐水，继续孵化后，取出鸡蛋，剥除外膜，获得鸡胚绒毛膜尿囊膜；
(2)浓度筛选：在鸡胚绒毛膜尿囊膜表面加入一系列不同浓度的受试物，孵育10分钟-24小时后，取出鸡胚，观察血管反应，选择无血管反应的受试物浓度；
(3)绒毛膜尿囊膜与受试物预处理孵育反应：选择无血管反应的1-5个浓度的受试物，加入鸡胚绒毛膜尿囊膜表面，进行预处理孵育反应10分钟-24小时；
(4)加入刺激物进行反应：在预处理孵育反应后的鸡胚绒毛膜尿囊膜表面加入刺激物，进行孵化反应10-60分钟，造成刺激性反应，其中所述刺激物为乳酸或十二烷基硫酸钠；
(5)计算：根据受试物反应，计算刺激评分IS，其中刺激评分IS的计算通过以下公式：
刺激评分IS＝[5×(301-H)+7×(301-L)+9×(301-C)]/300
其中H、L和C分别为计时5分钟首次出现出血的时间、溶血的时间和凝血的时间；
如果受试物刺激评分IS为对照品的1/2或1/2以下时，认为该受试物具有潜在抗刺激效果。


2.根据权利要求1所述的采用鸡胚绒毛膜尿囊膜的抗刺激体外评价方法，其特征是：步骤(1)中所述种蛋为育龄为0-9天的SPF级的白莱杭鸡、星杂288、麻黄、白洛克或岭南黄鸡的受精鸡胚，进行孵育时，选取收获0天的种蛋，经消毒后置于孵化箱进行孵育，孵育温度为36.5±1.5℃。


3.根据权利要求1所述的采用鸡胚绒毛膜尿囊膜的抗刺激体外评价方法，其特征是：步骤(1)中选取9-13天鸡胚，所述鸡胚的质量为50-70克，选取存活的鸡胚，并标记鸡胚气室位置。


4.根据权利要求1所述的采用鸡胚绒毛膜尿囊膜的抗刺激体外评价方法，其特征是：步骤(1)中去除蛋壳，暴露蛋膜，在...

【专利技术属性】
技术研发人员：畅绍念，朱文俊，李维锋，
申请(专利权)人：广东三好科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44