一种新的快速鸡胚盘的分离方法技术

本发明专利技术公开了一种新的快速鸡胚盘的分离方法：首先将鸡胚钝端向上握在手中，用镊子尖头轻轻在受精蛋中部钻出一个小孔后，将镊子一端插入小孔，沿着赤道线方向，依次用镊子夹碎蛋壳，延赤道线分离蛋壳一圈后，轻轻的剥离钝端蛋壳，在此过程中应尽量保持鸡胚水平，防止卵黄随蛋清流出；剥离蛋壳后，用镊子将蛋清从卵黄中分离；使用镊子的侧面拨动卵黄，寻找胚盘；找到胚盘后，尽量将胚盘拨到正中央，用剪刀沿胚盘四周呈正方形剪开，此时，使用镊子夹住将含有胚盘的正方形卵黄膜一角，沿水平方向轻轻拉出来，将此卵黄膜放入37℃的PBS的培养皿中，轻轻晃动培养皿,使卵黄和卵黄膜从胚盘上脱离下来，从而获得了完整的胚盘。

【技术实现步骤摘要】

:本专利技术涉及干细胞工程、珍稀物种的保存和组织与细胞工程等领域。技术背景:目前对鸡胚盘的分离主要有三种方法，药勺获取法，滤纸纸环法和发环法。这三种方法都需要通过去除新鲜受精蛋钝端蛋壳和壳膜，使其成直径3?4cm的圆孔，暴露出卵黄及胚盘，然后再进行胚盘的分离。药勺法主要采用眼科剪顺着胚盘的边缘小心剪取胚盘，药勺圉出后放入到盛有37°C的PBS的培养皿中。轻轻晃动培养皿，使卵黄和卵黄膜从胚盘上脱离下来。然后用药勺小心翼翼地将胚盘从培养皿中取出，放入另一盛有温热PBS的培养皿中，进行后续试验。纸环法，剪一滤纸圈，中央圆孔的直径略大于胚盘，将纸圈轻压到蛋白下面，使之与胚盘紧贴，并使胚盘位于圆孔中央。左手执眼科镊子夹住纸圈边缘，右手用剪刀沿纸圈剪下(胚盘边缘粘连在纸圈上，胚胎完整)，用镊子将纸圈移入到盛有温热PBS的培养皿中，轻轻晃动使胚盘上面的卵黄膜及其下面的卵黄去掉，进行后续试验。发环法是将圆形胚盘剪开，挑入盛有温热PBS的培养皿中。用头发环层层剔除蛋黄，再用PBS洗涤几次，直到完全去掉蛋黄及蛋黄膜，进行后续试验。
技术实现思路
:针对目前鸡胚盘分离时间长、效率低且分离胚盘不完整、卵黄颗粒残留较多等问题，本专利技术采用仅使用镊子分离胚盘的快速分离方法，具有分离速度快、纯度高及胚盘完整等优势。采用本方法，每小时两人平均可分离鸡胚100枚，与传统方法比较发现，以目前常用的药勺法为例，每小时两人可分离鸡胚50枚，提高效率两倍，并且分离的鸡胚盘更加的完整，卵黄颗粒更少，纯度更高。专利技术提出的快速鸡胚盘的分离方法具有巨大的应用前景，为鸡胚胎干细胞的研宄体提供了重要的技术保障。本专利技术目的在于为人们提供。本专利技术包括以下步骤:1.鸡胚的清洗选用出生后未孵化的第X期新鲜受精种蛋，使用医用纱布浸润浓度为0.1%新洁尔灭，对种蛋进行彻底清洗后，使用75%的酒精再次彻底消毒备用；2.试剂及器械的准备；配制pH值为7.5的IXPBS缓冲液1L，高压后备用。准备6个90mm培养皿，2把1cm眼科直镊，2把14cm直剪刀，2只16cm吸管，两块50*50cm纱布，清洗烘干后，装入不锈钢高压盒中高压备用，酒精棉球若干；3.超净工作台的清洁医用纱布经0.1 %新洁尔灭浸润后对超净工作台进行彻底清洗，待其风干后再使用75%的酒精棉球消毒，然后用波长为250nm-260nm紫外线照射消毒30mins后通风使用；4.操作人员准备操作人员穿着白大褂，双手经浓度为0.1%新洁尔灭消毒，再次使用75%酒精消毒，风干后，佩带乳胶手套并开展试验；5.蛋壳的剥离超净工作台通风15mins后，开始鸡胚盘分离实验，首先将鸡胚钝端向上握在手中，用镊子尖头轻轻在受精蛋中部钻出一直径为0.2-0.5cm小孔，将镊子一端插入小孔，插入不要过深，0.2-0.5cm为宜，沿着赤道线方向，依次用镊子夹碎蛋壳，用力不要过猛，仅夹碎镊子中间蛋壳即可，延赤道线分离蛋壳一圈后，轻轻的剥离钝端蛋壳，在此过程中应保持鸡胚水平，防止卵黄随蛋清流出；6.蛋清的分离剥离蛋壳后，手中剩余蛋壳部分缓慢倾斜15-20度角后，让蛋清自然流出，部分未流出蛋清可用镊子轻轻拖出，动作需谨慎，切勿将卵黄倒出，大部分蛋清分离后手中的蛋壳应恢复水平；7.胚盘的寻找使用镊子的侧面从卵黄的边缘拨动旋转卵黄，寻找受精胚盘，切勿使用尖端；8.胚盘的形态特征识别鸡受精卵在母体内不断分裂，产出后为X期，已经分裂成一团细胞，从卵黄的表面观察为直径约为0.5-0.6cm白色半透明圆盘，未受精蛋只能在卵黄表面观察到一直径为0.1-0.2cm不规则的白色小点；9.胚盘的分离找到胚盘后，用镊子的侧面将胚盘拨到正中央，用剪刀沿胚盘四周呈lcm*lcmE方形剪开，距离胚盘不宜过紧，每侧留出0.3cm左右边距，使用镊子夹住将含有胚盘的的正方形卵黄膜一角，沿水平方向轻轻拉出来，保持水平，减少带出的卵黄数量，将上述卵黄膜放入37°C的PBS的培养皿中，轻轻晃动培养皿，使卵黄和卵黄膜从胚盘上脱离下来，从而获得了完整的胚盘。本方法的专利技术，主要为了提高鸡胚盘的分离效率，并且获得完整的胚盘，减少卵黄颗粒的残留。采用本方法，每小时两人平均可分离鸡胚100枚，与传统方法比较发现，以目前常用的药勺法为例，每小时两人可分离鸡胚50枚，提高效率两倍，大大缩短胚盘的分离时间，提高分离效率，并且分离的鸡胚盘更加的完整，且卵黄颗粒残留较少，纯度更高。本专利技术的优越性在于:1.分离速度快；2.方法简单易行，可重复性强，在普通实验室即可进行；3.运用该方法获取的胚盘完整，能够满足一般试验的需要；4.采用本方法，每小时2人平均可分离鸡胚100枚，与传统方法比较后发现:以目前常用的药勺法为例，每小时2人可分离鸡胚50枚，提高效率2倍，并且分离的鸡胚盘更加完整，卵黄颗粒更少，每个胚盘可以获得5-6万个胚胎干细胞，且纯度更高；5.为禽类胚盘细胞的分离提供了新的方法，同时也为今后鸡胚盘细胞后续研宄提供了方法和途径；6.该技术也适用于其它卵生动物的胚盘细胞的分离，可用于珍贵物种的利用与开发。【具体实施方式】1.蛋壳的剥离超净工作台通风15mins后，开始鸡胚盘分离实验，首先将鸡胚钝端向上握在手中，用镊子尖头轻轻在受精蛋中部钻出一直径为0.2-0.5cm小孔，将镊子一端插入小孔，插入不要过深，0.2-0.5cm为宜，沿着赤道线方向，依次用镊子夹碎蛋壳，用力不要过猛，仅夹碎镊子中间蛋壳即可，延赤道线分离蛋壳一圈后，轻轻的剥离钝端蛋壳，在此过程中应保持鸡胚水平，防止卵黄随蛋清流出；2.蛋清的分离剥离蛋壳后，手中剩余蛋壳部分缓慢倾斜15-20度角后，让蛋清自然流出，部分未流出蛋清可用镊子轻轻拖出，动作需谨慎，切勿将卵黄倒出，大部分蛋清分离后手中的蛋壳应恢复水平；3.胚盘的寻找使用镊子的侧面从卵黄的边缘拨动旋转卵黄，寻找受精胚盘，切勿使用尖端；4.胚盘的形态特征识别鸡受精卵在母体内不断分裂，产出后为X期，已经分裂成一团细胞，从卵黄的表面观察为直径约为0.5-0.6cm白色半透明圆盘，未受精蛋只能在卵黄表面观察到一直径为0.1-0.2cm不规则的白色小点；5.胚盘的分离找到胚盘后，用镊子的侧面将胚盘拨到正中央，用剪刀沿胚盘四周呈lcm*lcmE方形剪开，距离胚盘不宜过紧，每侧留出0.3cm左右边距，使用镊子夹住将含有胚盘的的正方形卵黄膜一角，沿水平方向轻轻拉出来，保持水平，减少带出的卵黄数量，将上述卵黄膜放入37°C的PBS的培养皿中，轻轻晃动培养皿，使卵黄和卵黄膜从胚盘上脱离下来，从而获得了完整的胚盘。【主权项】1.，其特征在于:包括如下步骤: (1)鸡胚的清洗 选用出生后未孵化的第X期新鲜受精种蛋，使用医用纱布浸润浓度为0.1 %新洁尔灭，对种蛋进行彻底清洗后，使用75%的酒精再次彻底消毒备用； (2)试剂及器械的准备 配制PH值为7.5的IXPBS缓冲液1L，高压后备用，准备6个90mm培养皿，2把1cm眼科直镊，2把14cm直剪刀，2只16cm吸管，两块50*50cm纱布，清洗烘干后，装入不锈钢高压盒中高压备用，酒精棉球若干； (3)超净工作台的清洁 医用纱布经0.1 %新洁尔灭浸润后对超净工作台进行彻底清洗，待其风干后再使用.75%的酒精棉球消毒，然后用波长为本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种新的快速鸡胚盘的分离方法，其特征在于：包括如下步骤：(1)鸡胚的清洗选用出生后未孵化的第X期新鲜受精种蛋，使用医用纱布浸润浓度为0.1％新洁尔灭，对种蛋进行彻底清洗后，使用75％的酒精再次彻底消毒备用；(2)试剂及器械的准备配制pH值为7.5的1XPBS缓冲液1L，高压后备用，准备6个90mm培养皿，2把10cm眼科直镊，2把14cm直剪刀，2只16cm吸管，两块50*50cm纱布，清洗烘干后，装入不锈钢高压盒中高压备用，酒精棉球若干；(3)超净工作台的清洁医用纱布经0.1％新洁尔灭浸润后对超净工作台进行彻底清洗，待其风干后再使用75％的酒精棉球消毒，然后用波长为250nm‑260nm紫外线照射消毒30mins后通风使用；(4)操作人员准备操作人员穿着白大褂，双手经浓度为0.1％新洁尔灭消毒，再次使用75％酒精消毒，风干后，佩带乳胶手套并开展试验；(5)蛋壳的剥离超净工作台通风15mins后，开始鸡胚盘分离实验，首先将鸡胚钝端向上握在手中，用镊子尖头轻轻在受精蛋中部钻出一直径为0.2‑0.5cm小孔，将镊子一端插入小孔，插入不要过深，0.2‑0.5cm为宜，沿着赤道线方向，依次用镊子夹碎蛋壳，用力不要过猛，仅夹碎镊子中间蛋壳即可，延赤道线分离蛋壳一圈后，轻轻的剥离钝端蛋壳，在此过程中应保持鸡胚水平，防止卵黄随蛋清流出；(6)蛋清的分离剥离蛋壳后，手中剩余蛋壳部分缓慢倾斜15‑20度角后，让蛋清自然流出，部分未流出蛋清可用镊子轻轻拖出，切勿将卵黄倒出，大部分蛋清分离后手中的蛋壳应恢复水平；(7)胚盘的寻找使用镊子的侧面从卵黄的边缘拨动旋转卵黄，寻找受精胚盘，切勿使用尖端；(8)胚盘的形态特征识别；鸡受精卵在母体内不断分裂，产出后为X期，已经分裂成一团细胞，从卵黄的表面观察为直径约为0.5‑0.6cm白色半透明圆盘，未受精蛋只能在卵黄表面观察到一直径为0.1‑0.2cm不规则的白色小点；(9)胚盘的分离找到胚盘后，用镊子的侧面将胚盘拨到正中央，用剪刀沿胚盘四周呈1cm*1cm正方形剪开，距离胚盘不宜过紧，每侧留出0.3cm左右边距，使用镊子夹住将含有胚盘的的正方形卵黄膜一角，沿水平方向轻轻拉出来，保持水平，减少带出的卵黄数量，将上述卵黄膜放入37℃的PBS的培养皿中，轻轻晃动培养皿,使卵黄和卵黄膜从胚盘上脱离下来，从而获得了完整的胚盘。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：李碧春，张亚妮，张振韬，左其生，李东，张蕾，连超，肖天荣，汤贝贝，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32