本发明专利技术涉及一种测定溶液中γ‑PGA浓度的亚甲基蓝比色法，采取以下步骤：(1)制备亚甲基蓝与γ‑PGA水溶液；(2)亚甲基蓝与γ‑PGA水溶液混合反应；(3)亚甲基蓝与γ‑PGA混合溶液在200到800nm下全波长扫描；(4)判断全波长扫描光谱类型；(5)根据标准曲线计算γ‑PGA浓度，本发明专利技术的目的是提供一种测定溶液中γ‑PGA浓度的亚甲基蓝比色法，解决了紫外分光光度法测定γ‑PGA浓度时的谷氨酸干扰问题，还完善了亚甲基蓝比色法测定未知溶液中γ‑PGA浓度，同时解决了亚甲基蓝比色法测定γ‑PGA浓度时的亚甲基蓝干扰问题，方便快捷，准确可靠，可用于未知溶液中γ‑PGA浓度的测定。
A methylene blue colorimetric method for the determination of \u03b3 - PGA in solution
【技术实现步骤摘要】
一种测定溶液中γ-PGA浓度的亚甲基蓝比色法
本专利技术提供一种测定溶液中γ-PGA浓度的亚甲基蓝比色法，属于生物
的一种分光光度法检测方法，可在应用于测定未知γ-PGA含量的溶液样品，特别是在γ-PGA的高产菌株筛选与发酵过程中的监控和富含PGA的固体底物的检测。
技术介绍
聚谷氨酸(γ-PGA)主要是由芽孢杆菌发酵产生的一种胞外水溶性天然高分子氨基酸聚合物，由D-谷氨酸(D-Glu)或L-谷氨酸(L-Glu)通过α－氨基和γ－羧基通之间的酰胺键连接而成的多肽分子，而微生物合成的γ-PGA通常由5000个左右的谷氨酸单体组成，其相对分子质量在100-1000kD之间。由于γ-PGA分子结构上存在活泼的官能团羧基(-COOH)，无毒性、可食用性、吸附性、二聚体性、生物相容性和非免疫原性等生物性能，使其成为低温保护剂、苦味缓解剂、缓释材料、药物载体、外科粘结剂、可生物降解纤维、热塑性、高吸水性水凝胶等多种工业应用中的重要生物材料，因此，γ-PGA在农业，化妆品，医疗，环保、食品和废水净化工业等各个领域具有非常良好的应用前景与开发利用价值。目前已有多种方法用于测定γ-PGA含量，如干重分析、凝胶渗透色谱测定(GPC)，高效液相色谱(HPLC)测定，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，比浊测定法，紫外分光光度法和比色法等；曾伟等人建立紫外分光光度法检测γ-PGA含量的快速方法，即在216nm测定γ-PGA含量；由于发酵过程中γ-PGA会被水解生成低分子量的γ-PGA和谷氨酸，而且谷氨酸(215nm)和γ-PGA(216nm)的最大吸光值的波长相差不大，所以很难用分光分度法精确确定同一瓶发酵液中的γ-PGA和谷氨酸的含量；而刘鹏丽等人建立比色法快速测定发酵液中γ－聚谷氨酸含量，结果表明亚甲基蓝与具有聚阴离子性质的γ-PGA发生反应之后在664nm处的吸光度大小与γ-PGA浓度成正比；但是，由于亚甲基蓝的最大吸收波长也在664nm，通过测定664nm下的吸光度，可能是由未反应的亚甲基蓝引起，或者是由γ-PGA与亚甲基蓝络合物引起的，因此，无法通过单波长检测来确定未知溶液中γ-PGA的含量。亚甲基蓝(Methyleneblue)是一种芳香杂环化合物，常被用作化学指示剂、生物染色剂、染料和药物等；γ-PGA是阴离子生物聚合物，分子侧链上具有活泼的羧基(-COOH)，可以促进阳离子碱性染色剂的化学吸附；2010年PoonamMishraChatterjee等人第一次用0.04g/L的亚甲基蓝培养基筛选产γ-PGA的高产菌株；2017年，FumihikoOgata等人研究了阳离子碱性染料亚甲基蓝与γ-PGA的吸附性能，结果表明，γ-PGA吸附剂可作为一种高效的亚甲基蓝染料吸附剂，在环境及相关领域有潜在的应用前景；2019年，刘鹏丽等人建立发酵液中γ－聚谷氨酸(γ-PGA)含量快速测定的比色检测方法，但通过测定664nm下的吸光度，可能是由未反应的亚甲基蓝引起，或者是由γ-PGA与亚甲基蓝络合物引起的，因此，通过单波长检测来确定未知溶液中γ-PGA的含量存在不确定性。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种测定溶液中γ-PGA浓度的亚甲基蓝比色法，解决了紫外分光光度法测定γ-PGA浓度时的谷氨酸干扰问题，还完善了亚甲基蓝比色法测定未知溶液中γ-PGA浓度，同时解决了亚甲基蓝比色法测定γ-PGA浓度时的亚甲基蓝干扰问题，方便快捷，准确可靠，可用于未知溶液中γ-PGA浓度的测定。为了实现以上目的，本专利技术采用的技术方案为：一种测定溶液中γ-PGA浓度的亚甲基蓝比色法，采取以下步骤：(1)制备亚甲基蓝与γ-PGA水溶液；(2)亚甲基蓝与γ-PGA水溶液混合反应；(3)亚甲基蓝与γ-PGA混合溶液在200到800nm下全波长扫描；(4)判断全波长扫描光谱类型；(5)根据标准曲线计算γ-PGA浓度。优选的，步骤(2)中，γ-PGA水溶液与4μg/ml亚甲基蓝溶液在pH＝6.5下反应时间为3h。优选的，步骤(3)的具体操作，打开电脑桌面工作站软件UVprobe，打开UV-2700，仪器自检完，选择“光谱扫描”模式，点击软件上方的“M”按钮，设置参数，波长范围为200nm～800nm，输出参数为吸光值，将两个空白样品放入样品仓，点击“自动调零”，调零后将待测样品放入样品仓，点击“开始”进行测试，运行结束后，保存光谱图、数据打印表和峰值检测表。优选的，步骤(4)中，根据已测试样品的光谱图的最大吸收波长判断全波长扫描光谱类型，若最大吸收波长在664nm，即为浓度在0～3.5μg/ml的γ-PGA与4μg/ml亚甲基蓝溶液的全波长扫描光谱图；若最大吸收波长在596nm，即为浓度在10～100μg/ml的γ-PGA与4μg/ml亚甲基蓝溶液的全波长扫描光谱图；若最大吸收波长在288.5nm，即为浓度在100～600μg/ml的γ-PGA与4μg/ml亚甲基蓝溶液的全波长扫描光谱图。可以根据在25℃下，含有未知浓度的γ-PGA溶液与4μg/ml亚甲基蓝溶液在pH＝6.5下反应时间为3h，然后用UV-2700检测待测液在200nm～800nm全波长扫描，通过光谱图和最大波长和最大吸收值判断γ-PGA浓度范围，再根据γ-PGA标准曲线计算γ-PGA浓度。γ-PGA浓度在0～7μg/ml之间时，与4μg/ml亚甲基蓝反应3h，在664nm处吸光度随γ-PGA浓度升高而减少；当γ-PGA浓度在7～800μg/ml之间时，与4μg/ml亚甲基蓝反应3h，在664nm处吸光度随γ-PGA升高而升高。在微生物合成的γ-PGA通常由5000个左右的谷氨酸单体组成，γ-PGA的最大吸光值的波长在216nm，而谷氨酸的最大吸光值的波长在215nm，两者的最大吸光值的波长相差不大，因此很难用紫外分光光度法精确确定同一瓶发酵液中的γ-PGA和谷氨酸的含量；此外，由于亚甲基蓝的最大吸收波长也在664nm，通过测定664nm下的吸光度，可能是由未反应的亚甲基蓝引起，或者是由γ-PGA与亚甲基蓝络合物引起的，因此，无法通过单波长检测来确定未知溶液中γ-PGA的含量；本专利技术与现有技术相比，不仅解决了紫外分光光度法测定γ-PGA浓度时的谷氨酸干扰问题，还完善了亚甲基蓝比色法测定未知溶液中γ-PGA浓度，同时解决了亚甲基蓝比色法测定γ-PGA浓度时的亚甲基蓝干扰问题，新亚甲基蓝比色法操作简单，方便快捷，准确可靠，可用于未知溶液中γ-PGA浓度的测定。附图说明：图1A是0～7μg/mlγ-PGA与4μg/ml亚甲基蓝溶液在25℃，pH＝6.5下反应3h后的200nm～800nm的紫外可见分光光谱图，从上到下γ-PGA浓度分别是0μg/ml、0.5μg/ml、1μg/ml、1.5μg/ml、2μg/ml、2.5μg/ml、3μg/ml、3.5μg/ml、4μg/ml、5μg/ml、6μg/ml和7μg/ml，图1B是以γ-PGA浓度(μg/ml)为横坐标，γ-PGA与亚甲基蓝混合液在664n本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种测定溶液中γ-PGA浓度的亚甲基蓝比色法，其特征在于，采取以下步骤：(1)制备亚甲基蓝与γ-PGA水溶液；(2)亚甲基蓝与γ-PGA水溶液混合反应；(3)亚甲基蓝与γ-PGA混合溶液在200到800nm下全波长扫描；(4)判断全波长扫描光谱类型；(5)根据标准曲线计算γ-PGA浓度。/n
【技术特征摘要】
1.一种测定溶液中γ-PGA浓度的亚甲基蓝比色法，其特征在于，采取以下步骤：(1)制备亚甲基蓝与γ-PGA水溶液；(2)亚甲基蓝与γ-PGA水溶液混合反应；(3)亚甲基蓝与γ-PGA混合溶液在200到800nm下全波长扫描；(4)判断全波长扫描光谱类型；(5)根据标准曲线计算γ-PGA浓度。
2.根据权利要求1所述的一种测定溶液中γ-PGA浓度的亚甲基蓝比色法，其特征在于，步骤(2)中，γ-PGA水溶液与4μg/ml亚甲基蓝溶液在pH＝6.5下反应时间为3h。
3...
【专利技术属性】
技术研发人员：邱华贤，胡思婷，邹水洋，郭俊贤，
申请(专利权)人：东莞理工学院，
类型：发明
国别省市：广东;44
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