一种卵巢癌循环肿瘤细胞检测试剂盒制造技术

本发明专利技术提供了一种卵巢癌循环肿瘤细胞检测试剂盒，用于检测已经脱离卵巢进入外周血中的循环肿瘤细胞，包括转铁蛋白免疫磁球、染色剂、引物组、分离膜、高保真Taq酶、2×Blood Direct PCR Master Mix、ddH

A test kit for circulating tumor cells in ovarian cancer

【技术实现步骤摘要】
一种卵巢癌循环肿瘤细胞检测试剂盒
本专利技术涉及生物技术与生物医学领域，具体涉及一种卵巢癌循环肿瘤细胞检测试剂盒。
技术介绍
研究统计数据表明，卵巢癌的发病率仅次于宫颈癌和乳腺癌，但其死亡率却是妇科肿瘤中最高的。其原因主要是卵巢癌缺乏有效的早期诊断方法，而且早期临床体征不明显，70％的患者确诊时已经到了肿瘤晚期。另一方面，治疗效果仍然不太理想，5年生存期没有有效提高。循环肿瘤细胞(CirculatingTumorCell，CTC)是指脱离肿瘤并进入血液循环的癌细胞，这种远端转移是导致肿瘤患者死亡的主要原因，近年来其在恶性肿瘤转移过程中的作用日益受到关注。CTC的检测可有效地应用于肿瘤的体外早期诊断，具有重要临床意义和广阔应用前景。Veridex公司的CirculatingTumorCell检测试剂盒应用于临床转移性乳腺癌患者的诊断与治疗评价。该技术通过偶联细胞上皮粘附蛋白(epiithlialcelladhesionmolecule-EpCAM)抗体的磁珠捕获细胞，并利用角蛋白和CD45荧光抗体对细胞进行鉴定。然而由于卵巢癌特殊的转移倾向(局部蔓延和淋巴结转移)使得该敏感性偏低的检测技术捕获的细胞数量极少，CTC的临床诊疗价值大打折扣。基因检测可以诊断疾病，也可以用于疾病风险的预测。疾病诊断是用基因检测技术检测引起遗传性疾病的突变基因,目前应用于遗传性疾病的检测、遗传疾病的诊断和某些常见病的辅助诊断。
技术实现思路
本专利技术是为了解决上述问题而进行的，目的是开发出特异性强、灵敏度高、能准确捕获已经脱离卵巢的CTC，并可以对捕获的CTC准确计数以及后续基因检测的试剂盒。本专利技术提供了一种卵巢癌循环肿瘤细胞检测试剂盒，用于检测已经脱离卵巢进入外周血中的循环肿瘤细胞，具有这样的特征，包括：转铁蛋白免疫磁球，用于捕获循环肿瘤细胞，其制备过程如下：第一步骤，按羧甲基壳聚糖十六烷基季铵盐：胆固醇＝1：0.5～1：5的质量比，将羧甲基壳聚糖十六烷基季铵盐与胆固醇混合并加入到三口烧瓶中；第二步骤，按去乙醇后的磁珠溶液：CH2Cl2＝1：1～1：5的体积比，将去乙醇后的磁珠溶液溶解于CH2Cl2，获得第一溶液；第三步骤，按第一溶液：第一步骤的混合物＝1：1～1：5的体积质量比，将第一溶液倒入第一步骤中的三口烧瓶里，获得第二溶液；第四步骤，将第二溶液在冰浴下乳化2min～20min，并在乳化时把溶于双蒸水的环氧丙基十六叔胺转铁蛋白按体积质量比，磁珠溶液：环氧丙基十六叔胺转铁蛋白＝1：1～1：5，加入正在乳化的第二溶液中，乳化完成后得到第三溶液；第五步骤，去除第三溶液中残留的CH2Cl2，得到第四溶液；第六步骤，将第四溶液进行磁分离，获得转铁蛋白免疫磁球；第七步骤，清洗转铁蛋白免疫磁球。本专利技术提供的卵巢癌循环肿瘤细胞检测试剂盒，还具有这样的特征：其中，环氧丙基十六叔胺转铁蛋白的制备过程如下：步骤Ⅰ，按转铁蛋白：环氧丙基十六叔胺＝1：1～1：5的质量比，将转铁蛋白和环氧丙基十六叔胺共溶于pH＝7.4的磷酸盐缓冲液中；步骤II，将步骤Ⅰ中的溶液搅拌反应过夜；步骤III，将过夜后的溶液用分子量为5000～20000道尔顿的透析袋透析6h～24h，透析过程中每间隔两个小时换一次pH＝7.4的磷酸盐缓冲液；步骤IV，完成透析后冻干，即获得环氧丙基十六叔胺转铁蛋白。本专利技术提供的卵巢癌循环肿瘤细胞检测试剂盒，还包括：染色剂，用在循环肿瘤细胞计数过程中对转铁蛋白免疫磁球捕获的循环肿瘤细胞进行染色，染色剂包括，DAPI、CK19-FITC以及CD45-PE。本专利技术提供的卵巢癌循环肿瘤细胞检测试剂盒，还包括：引物组，引物组包括EGFR19引物序列以及EGFR21引物序列，其中，EGFR19引物序列如下:EGFR19forward5’-GCCTAGACGCAGCATCATTA-3’；EGFR19inverse5’-ATGCCTCCATTTCTTCATCC-3’，EGFR21引物序列如下：EGFR21forward5’-GTAAGTTCAAGCCCAGGTCT-3’；EGFR21inverse5’-GCAAGTACTGTTCCCAAAGC-3’。本专利技术提供的卵巢癌循环肿瘤细胞检测试剂盒，还包括：分离膜，4于分离并收集受检者外周血中的包含循环肿瘤细胞的细胞群以便转铁蛋白免疫磁球捕获循环肿瘤细胞，分离膜的孔径为5μm。本专利技术提供的卵巢癌循环肿瘤细胞检测试剂盒，还包括：高保真Taq酶以及2×BloodDirectPCRMasterMix。本专利技术提供的卵巢癌循环肿瘤细胞检测试剂盒，还包括：ddH2O、RNase-FreeddH2O以及pH＝7.4的磷酸盐缓冲液。专利技术的作用与效果根据本专利技术所涉及的一种卵巢癌循环肿瘤细胞检测试剂盒，因为首先通过转铁蛋白免疫磁球强特异性、高灵敏度地捕获并分离受检者外周血中的CTC；再采用包含DAPI、CK19-FITC以及CD45-PE的染色剂对分离的CTC进行染色并进一步检测CTC阳性细胞数量；最后通过高特异性的EGFR19引物、EGFR21引物扩增出受检者的CTC中基因EGFR19及基因EGFR21的序列。所以，本专利技术提供的卵巢癌循环肿瘤细胞检测试剂盒能够从细胞层面上以及基因层面上准确检测受检者的CTC。附图说明图1是CTC数量与患者的分期之间的关系统计图；图2是CTC与患者临床分期病理参数的相关性分析图表；图3为某受检者EGFR19外显子和EGFR21外显子PCR后的琼脂糖凝胶电泳图；图4是图3中EGFR19外显子测序的结果图；图5是图3中EGFR21外显子测序的结果图；以及图6是图3中阳性对照中EGFR19外显子基因缺失突变序列图。具体实施方式为了使本专利技术实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，以下实施例结合附图对本专利技术一种卵巢癌循环肿瘤细胞检测试剂盒作具体阐述。<实施例一>本实施例供了一种卵巢癌循环肿瘤细胞检测试剂盒，用于捕获已经脱离卵巢进入外周血中的循环肿瘤细胞(CirculatingTumorCell，以下称CTC)，并对捕获的CTC进行计数检测，包括转铁蛋白免疫磁球、染色剂、分离膜、ddH2O、RNase-FreeddH2O以及pH＝7.4的磷酸盐缓冲液。本实施例的转铁蛋白免疫磁球，其制备过程如下：第一步骤，称取5mg羧甲基壳聚糖十六烷基季铵盐和5mg胆固醇加入到50ml三口烧瓶中；第二步骤，量取1.0ml去乙醇后的磁珠溶液溶解于3.0mlCH2Cl2中，获得第一溶液；第三步骤，将第一溶液倒入第一步骤中的三口烧瓶里中，获得第二溶液；第四步骤，将第二溶液在冰浴条件下使用探头超声仪进行乳化超声6min，并在乳化时把2mg环氧丙基十六叔胺转铁蛋白溶解于6ml双蒸水并加到第二溶液中，乳化完成后得到第三溶液；第五步骤，用旋转蒸发仪除去第三溶液中残留本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种卵巢癌循环肿瘤细胞检测试剂盒，用于检测已经脱离卵巢进入外周血中的循环肿瘤细胞，其特征在于，包括：/n转铁蛋白免疫磁球，用于捕获所述循环肿瘤细胞，其制备过程如下：/n第一步骤，按羧甲基壳聚糖十六烷基季铵盐：胆固醇＝1：0.5～1：5的质量比，将羧甲基壳聚糖十六烷基季铵盐与胆固醇混合并加入到三口烧瓶中；/n第二步骤，按去乙醇后的磁珠溶液：CH

【技术特征摘要】
1.一种卵巢癌循环肿瘤细胞检测试剂盒，用于检测已经脱离卵巢进入外周血中的循环肿瘤细胞，其特征在于，包括：
转铁蛋白免疫磁球，用于捕获所述循环肿瘤细胞，其制备过程如下：
第一步骤，按羧甲基壳聚糖十六烷基季铵盐：胆固醇＝1：0.5～1：5的质量比，将羧甲基壳聚糖十六烷基季铵盐与胆固醇混合并加入到三口烧瓶中；
第二步骤，按去乙醇后的磁珠溶液：CH2Cl2＝1：1～1：5的体积比，将去乙醇后的磁珠溶液溶解于CH2Cl2，获得第一溶液；
第三步骤，按所述第一溶液：第一步骤的混合物＝1：1～1：5的体积质量比，将所述第一溶液倒入第一步骤中的三口烧瓶里，获得第二溶液；
第四步骤，将所述第二溶液在冰浴下乳化2min～20min，并在乳化时把溶于双蒸水的环氧丙基十六叔胺转铁蛋白按体积质量比，磁珠溶液：环氧丙基十六叔胺转铁蛋白＝1：1～1：5，加入正在乳化的所述第二溶液中，乳化完成后得到第三溶液；
第五步骤，去除所述第三溶液中残留的CH2Cl2，得到第四溶液；
第六步骤，将所述第四溶液进行磁分离，获得所述转铁蛋白免疫磁球；
第七步骤，清洗所述转铁蛋白免疫磁球。


2.根据权利要求1所述的卵巢癌循环肿瘤细胞检测试剂盒，其特征在于：
其中，所述环氧丙基十六叔胺转铁蛋白的制备过程如下：
步骤Ⅰ，按转铁蛋白：环氧丙基十六叔胺＝1：1～1：5的质量比，将转铁蛋白和环氧丙基十六叔胺共溶于pH＝7.4的磷酸盐缓冲液中；
步骤II，将步骤Ⅰ中的溶液搅拌反应过夜；
步骤III，将过夜后的溶液用分子量为5000～20000道尔顿的透析袋透析6h～24h，透析过程中每间隔两个小时换一次pH＝7.4的磷酸盐缓冲液；<...

【专利技术属性】
技术研发人员：梁晓飞，宋萍，
申请(专利权)人：举康上海生物科技有限公司，湖州举康医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31