鲁氏耶尔森菌溶血素基因的主要致病性片段及筛选方法和应用技术

本发明专利技术涉及鲁氏耶尔森菌溶血素基因的主要致病性片段及筛选方法，属于分子生物学领域。本发明专利技术以致病性鲁氏耶尔森菌主要致病因子——溶血素基因为研究对象，按功能域分布及排列将yhlBA基因分为yhl‑B、yhl‑A1、yhl‑A2和yhl‑A3四个片段，成功克隆了yhlBA基因的四个片段，并进行四个基因片段的原核表达，对原核表达产物进行毒性分析。结果表明，在yhlBA基因四个片段中，yhl‑B基因片段的原核表达产物具有最高的细胞毒性，能显著抑制RTG‑2细胞的生长和增殖，并诱导RTG‑2细胞中炎症相关基因上调表达。因此，yhl‑B基因片段可作为后期致病性鲁氏耶尔森菌减毒疫苗制备的候选基因片段进一步研究，并为探索鲁氏耶尔森菌致病机制提供数据和可行性基础。

The main pathogenic fragment of hemolysin gene of Yersinia rougensis and its screening method and Application

【技术实现步骤摘要】
鲁氏耶尔森菌溶血素基因的主要致病性片段及筛选方法和应用
本专利技术涉及鲁氏耶尔森菌溶血素基因的主要致病性片段及筛选方法，属于分子生物学领域。
技术介绍
鲁氏耶尔森菌(Yersiniaruckeri)是鲑鳟鱼的重要细菌性病原，该菌为革兰氏阴性菌，感染后可引发鲑鳟鱼肠炎红嘴病(entericredmouth，ERM)，其主要临床症状为体表(尤其是头、嘴、鳃盖等部位)充血、肠道肿胀发炎等。自上世纪50年代首次在美国养殖的虹鳟体内分离到该菌以来，其宿主范围和地理分布均有明显扩大趋势，感染的鱼类主要包括鲑科鱼类、金鱼、鳗鲡、鲽鱼、鲟鱼、鲢鱼、鳙鱼、斑点叉尾鮰等，在欧洲各国及中国均有发现，严重阻碍了水产养殖业的健康发展，并带来重大经济损失。溶血素(hemolysin)是一种可使红血球细胞溶解的毒素，参与革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌的致病性，有时还表现出对不同类型有核细胞的溶细胞活性。溶血素基因在许多病原菌(如Escherichiacoli)中都被证明与细菌致病性相关。虹鳟肠炎红嘴病临床症状表现为多组织肿胀、发炎、充血，同时有研究表明，鲁氏耶尔本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种鲁氏耶尔森菌溶血素基因的主要致病性片段，其特征在于，所述基因为yhlBA基因，分为yhl-B、yhl-A1、yhl-A2和yhl-A3四个片段，四个片段的扩增引物如下：/n

【技术特征摘要】
1.一种鲁氏耶尔森菌溶血素基因的主要致病性片段，其特征在于，所述基因为yhlBA基因，分为yhl-B、yhl-A1、yhl-A2和yhl-A3四个片段，四个片段的扩增引物如下：








引物名称
引物序列


BF
5'-GGAATTCATGGGAGATCACTGGGTTAATAG-3'


BR
5'-CCGCTCGAGTTAAAAGATGTATGAGAAGT-3'


A1F
5'-GGAATTCATGAAAAATAAAATATTCAA-3'


A1R
5'-CCGCTCGAGTTATTCACCGCCGCCAATTCCTC-3'


A2F
5'-GGAATTCATGAAAACCTCTTGGGGAGGAATT-3'


A2R
5'-CCGCTCGAGTTAGATGCCACCTTTAGCTGAAAG-3'


A3F
5'-GGAATTCATGTTTAACGTTAAGCTTTCAGCT-3'


A3R
5'-CCGCTCGAGTTATTCGGTCACTTCTTTACCTT-3'






。


2.权利要求1所述的鲁氏耶尔森菌溶血素的主要致病性片段的筛选方法，其特征在于：
采用细菌基因组DNA提取试剂盒对鲁氏耶尔森菌基因组DNA进行提取，四个基因片段PCR扩增体系为：含Mg2SO4的10×Pfu反应缓冲液5μL，浓度为2mM的dNTP混合物5μL，浓度为10pmol/μL的上、下游引物各2μL，PfuDNA聚合酶0.5μL，浓度为50ng/μL的鲁氏耶尔森菌基因组DNA模板1μL，加水补足至50μL；
扩增反应条件：95℃预变性3min；95℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸2min，30个循环；72℃延伸10min。


3.权利要求1所述的鲁氏耶尔森菌溶血素基因的主要致病性片段的分段方法，其特征在于，按照软件分析预测的功能结构域，将yhlBA基因分为yhl-B、yhl-A...

【专利技术属性】
技术研发人员：王荻，李绍戊，赵景壮，曹永生，卢彤岩，陈福广，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院黑龙江水产研究所，
类型：发明
国别省市：黑龙;23