核糖体因子和其突变体及其在制备维生素B制造技术

本发明专利技术公开3个核糖体因子基因及其突变基因以及在制备维生素B

Ribosome factor and its mutants and the preparation of vitamin B

【技术实现步骤摘要】
核糖体因子和其突变体及其在制备维生素B12中的应用
本专利技术属于生物
，具体涉及核糖体因子的突变体,以及所述核糖体因子和其突变体在制备维生素B12中的应用。
技术介绍
维生素B12(VB12)在药物和食品工业中具有广泛的应用，其又叫钴胺素，属于咕啉类化合物，是唯一含金属元素的维生素类化合物，是B族维生素发现最晚的大分子有机化合物。根据咕啉环上方的配基（R基团）种类不同，维生素B12可分为：羟基钴胺素，脱氧腺苷钴胺素和甲基钴胺素。维生素B12参与了大量的生化反应过程包括DNA的合成和调控、脂肪酸的合成、氨基酸的代谢及能力的产生。由于维生素B12分子结构复杂，化学法人工合成需要消耗大量的人力与物力，而且合成周期长。在合成过程中对操作人员的要求过高，导致不能大量的生产。微生物发酵法目前是生产维生素B12的最廉价的方法，能够大量生产并推广其使用。目前，国内外针对维生素B12生产菌生物合成维生素B12的研究主要集中在发酵过程优化，主要涉及培养基包括碳氮源和金属离子的优化、甜菜碱的添加、鱼藤酮的添加，工艺条件包括pH和供氧的控制等。有文献报道通过在脱氮假单胞菌基因组上表达单拷贝的透明颤菌vgb基因来增加细胞生产维生素B12的能力（程立芳等,不同来源的尿卟啉原III转甲基酶在脱氮假单胞菌中的表达及其对生产维生素B12的影响.工业微生物，2017，第47卷第3期）。转录延伸因子是能够使基因转录不断进行的因子，如激活RNA聚合酶活性的蛋白质。核糖体循环因子RRF由frr编码，其在核糖体循环利用方面有重要作用。在Streptomycescoelicolor中过量表达RRF可以增强生长后期的蛋白合成，进而过量生产天然产物（HosakaT,XuJ,OchiK(2006)Increasedexpressionofribosomerecyclingfactorisresponsiblefortheenhancedproteinsynthesisduringthelategrowthphaseinanantibiotic-overproducingStreptomycescoelicolorribosomalrpsLmutant.MolMicrobiol61(4):883–897）。在Streptomycesavermitilis中过表达frr会增加阿维菌素的产量(.LiL,GuoJ,WenY,ChenZ,SongY,LiJ(2010)OverexpressionofribosomerecyclingfactorcausesincreasedproductionofavermectininStreptomycesavermitilisstrains.JIndMicrobiolBiotechnol37(7):673–679)，在Streptomycesdiastatochromogenes中过表达frr会增加丰加霉素的产量(MaZ,TaoL,BechtholdA,ShentuX,BianY,YuX(2014)Overexpressionofribosomerecyclingfactorisresponsibleforimprovementofnucleotideantibiotic-toyocamycininStreptomycesdiastatochromogenes1628.ApplMicrobiolBiotechnol98(11):5051–5058)。在Corynebacteriumglutamicum中过表达fusA（编码核糖体延伸因子G）和/或frr会增加异亮氨酸的产量(ZhaoJ1,HuX,LiY,WangX（2015），OverexpressionofribosomeelongationfactorGandrecyclingfactorincreasesL-isoleucineproductioninCorynebacteriumglutamicum.ApplMicrobiolBiotechnol.99(11):4795-805.)。然而，影响维生素B12产量的核糖体因子尚未见到报道。
技术实现思路
本专利技术人前期筛选出了一株高产维生素B12的苜蓿中华根瘤菌CGMCCNO.9638菌株（CN104342390A），可发酵生产维生素B12。通过对其进行诱变，获得产维生素B12能力提高的诱变菌株，专利技术人对其核糖体因子进行了挖掘分析，包括9个不同的核糖体因子，通过对其评价，发现在苜蓿中华根瘤菌CGMCCNO.9638中过表达核糖体结合因子A、核糖体翻译延伸因子Ts或核糖体翻译延伸因子NusA可以提高维生素B12的产量。经进一步研究，最终完成本专利技术，而提供三个核糖体因子和其突变体，及其在产维生素B12中的应用。首先本专利技术提供一种核糖体结合因子A的突变体，其氨基酸序列在SEQIDNo.2所示的基础上，第70位氨基酸替换为H。具体地，其氨基酸序列如SEQIDNo.34所示。本专利技术还提供一种核糖体翻译延伸因子Ts的突变体，其特征在于，其氨基酸序列在SEQIDNo.4所示的基础上，第211位氨基酸替换为L。具体地，其氨基酸序列如SEQIDNo.36所示。本专利技术还提供一种核糖体翻译延伸因子NusA的突变体，其氨基酸序列在SEQIDNo.6所示的基础上，第173位氨基酸替换为S。具体地，其氨基酸序列如SEQIDNo.38所示。其次，本专利技术提供如上述的突变体的编码基因，具体地核糖体结合因子A编码基因核苷酸序列如SEQIDNo.33所示；核糖体翻译延伸因子Ts编码基因核苷酸序列如SEQIDNo.35所示；核糖体转录延伸因子NusA编码基因核苷酸序列如SEQIDNo.37所示。第三方面，本专利技术提供核糖体结合因子A、核糖体翻译延伸因子Ts或核糖体翻译延伸因子NusA的编码基因在制备产维生素B12中的应用。所述核糖体结合因子A编码基因编码具有如SEQIDNo.2、或SEQIDNo.34所示氨基酸序列的多肽；所述核糖体翻译延伸因子Ts编码基因编码具有如SEQIDNo.4、或SEQIDNo.36所示氨基酸序列的多肽；所述或核糖体翻译延伸因子NusA编码基因编码具有如SEQIDNo.4、或SEQIDNo.36所示氨基酸序列的多肽。在一个具体实施方式中，通过含有所述编码基因的表达载体导入苜蓿中华根瘤菌中进行过表达。进一步地，该基因或突变基因位于质粒或染色体中。优选地，所述苜蓿中华根瘤菌具有CGMCCNO.9638保藏号的菌株。通过对6个核糖体因子的筛选研究，表明其中核糖体结合因子A、核糖体翻译延伸因子Ts和核糖体翻译延伸因子NusA及其突变体基因在苜蓿中华根瘤菌中过表达，不仅对基因工程菌生物安全（在菌内过表达未对菌体的生长造成影响），同时可以有效的提高苜蓿中华根瘤菌生产维生素B12的能力。实验数据表明其中对于原始基因在苜蓿中华根瘤菌中过表达，核糖体结合因子A、核糖体翻译延伸因子Ts和核糖体翻译延伸因子NusA编码过表达提高苜蓿中华根瘤菌产维生素B12的能力，尤其是它们的突变体基因过表达能更进一本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种核糖体结合因子A的突变体，其特征在于，其氨基酸序列在SEQ ID No.2所示的基础上，第70位氨基酸替换为H。/n

【技术特征摘要】
1.一种核糖体结合因子A的突变体，其特征在于，其氨基酸序列在SEQIDNo.2所示的基础上，第70位氨基酸替换为H。


2.一种核糖体翻译延伸因子Ts的突变体，其特征在于，其氨基酸序列在SEQIDNo.4所示的基础上，第211位氨基酸替换为L。


3.一种核糖体翻译延伸因子NusA的突变体，其特征在于，其氨基酸序列在SEQIDNo.6所示的基础上，第173位氨基酸替换为S。


4.如权利要求1至3任一项所述的突变体的编码基因。


5.核糖体结合因子A、核糖体翻译延伸因子Ts或核糖体翻译延伸因子NusA编码基因在制备维生素B12中的应用，其中，所述核糖体结合因子A编码基因编码具有如SEQIDNo.2、或SEQIDNo.34...

【专利技术属性】
技术研发人员：张大伟，董会娜，马延和，
申请(专利权)人：中国科学院天津工业生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：天津;12