用于检测水稻耐冷基因CTB4a的特异性分子标记及应用制造技术

本发明专利技术公开了用于检测水稻耐冷基因CTB4a的特异性分子标记，该特异性分子标记命名为SNP2063，分子标记多态性为T/C，使用一组引物组合来检测，所述引物组合包括引物ctb4a‑Ft、ctb4a‑Fc和ctb4a‑R。本发明专利技术的分子标记检测抗水稻耐冷基因CTB4a特异性高，提供的分子标记的应用方法操作方便，检测结果准确可靠，可用于水稻耐冷基因CTB4a的鉴定及辅助育种，能够解决传统选育的效率低和周期长的难题。

【技术实现步骤摘要】
用于检测水稻耐冷基因CTB4a的特异性分子标记及应用
本专利技术属于分子生物学
，涉及用于检测水稻耐冷基因CTB4a的特异性分子标记及应用。
技术介绍
水稻(OryzasativaL.)是重要的粮食作物。世界上以稻米为主食的人口约占50％，亚洲地区对稻米的需求量逐年增加。由于全球经济快速发展、人口压力增大、工业用地剧增、耕地面积减少，水稻生产面临巨大的压力，因此持续提高和挖掘水稻的高产潜力，是科学家们的主要研究方向。水稻芽期耐冷与水稻的品质、产量有着密切的关系。低温是影响水稻产量的一个重要限制因子，水稻在芽期对低温敏感，粳稻和籼稻分别在15℃和18℃以下就发生冷害。水稻在芽期遭受冷害，会引起水稻种子萌发受到阻碍、生长点停止生长，长期的低温会导致种子的死亡。在高纬度和高海拔地区，水稻播种期的气温较低，使得许多水稻品种的推广都受到了限制。野生稻在复杂的自然环境中生长，蕴含着大量优异基因，在广西桂林北部生长的野生稻，能够在零下温度正常越冬、发芽、生长，蕴含着大量耐冷基因。近年来，使用分子生物学方法克隆水稻芽期耐冷基因成为研究的热点，克隆的野生稻芽期耐冷基因对水稻抗逆性改良有着重要的理论和现实指导意义。水稻耐冷机制尚未得到深入和系统研究，前人通过正向克隆获得几个基因，分别是qLTG3-1，COLD1，LTG1,LTT7,ctb1，CTB4a，几个耐冷基因广泛参与了信号转导的过程。Fujino克隆了其中一个QTLqLTG3-1，该基因在胚中表达，编码一个未知蛋白；Liu等利用强耐冷材料IL112和冷敏感材料桂朝2号进行杂交，在后代群体中定位了7个耐冷QTL，结合表达谱分析，获得了一个耐冷基因LTT7基因编码伸展类蛋白，与播种后低温下植株鲜重相关，诱导CBF类基因的表达来提高水稻的耐冷性；Lu等从耐冷的粳稻中克隆了耐冷基因LTG1，LTG1编码酪蛋白激酶，参与IAA的合成与调控，与低温下生长速率，抽穗期，产量相关(Lu,2014)；Ma等克隆了重要耐冷基因COLD1，COLD1与G蛋白α亚基RGA互作，激活Ca2+通道，而后增强G蛋白GTP酶活性，触发下游耐寒防御反应，而后加速G-蛋白GTP酶活性以平衡G-蛋白动态活性；Chen等揭示了水稻MADS-box家族转录因子OsMADS57协同其互作蛋白OsTB1，参与调控水稻的低温耐受性。水稻孕穗期耐冷基因CTB4a，是从云南地方品种昆明小白谷中克隆到的耐冷基因，编码在作物中十分保守的蛋白激酶，能够提高水稻应对低温的能力，从而提高花粉育性，增加结实率和产量。传统的水稻抗性育种是通过抗性鉴定对植株进行表型选择，耗费时间长，且易受环境条件的限制，鉴定结果容易造成误差，选择效率较低。利用分子标记辅助育种(MolecularMarker－assistedSelection，MAS)简单有效，可以降低育种成本，缩短选育周期。当今水稻耐冷育种的主要问题是可应用的耐冷基因太少，检测水稻耐冷基因，了解不同水稻品种的耐冷遗传背景，可以减少耐冷性育种工作的盲目性，提高育种效率，因此用基因特异性分子标记对水稻品种资源进行耐逆基因的鉴定十分重要。CTB4a基因是具有水稻耐冷功能的耐逆基因，耐冷功能在复杂的低温环境背景下仍然维持水稻的产量，适合引入到期望提高在高纬度地区推广种植面积的品种中开发CTB4a特异分子标记，将有助于水稻育种家在育种过程中为分子设计育种改良水稻抗逆性提供理论依据，最终实现高效育种，带来巨大的社会经济效益。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种用于检测耐冷基因CTB4a的特异性分子标记及应用。为实现本专利技术的目的，本专利技术的技术方案如下：本专利技术提供一种用于检测水稻耐冷基因CTB4a的特异性分子标记，所述的分子标记命名为SNP2063，分子标记多态性为T/C。所述的特异性分子标记可以使用一组引物组合来检测，所述引物组合包括引物ctb4a-Ft、ctb4a-Fc和ctb4a-R，ctb4a-Ft的序列如SEQ.ID.NO.1所示，ctb4a-Fc的序列如SEQ.ID.NO.2所示，ctb4a-R的序列如SEQ.ID.NO.3所示。含有上述引物组合的试剂或试剂盒属于本专利技术的保护范围。本专利技术提供了上述引物组合在检测水稻耐冷基因CTB4a中的应用。所述的应用，进一步包括以下步骤：(1)提取待测水稻基因组DNA；(2)以待测水稻基因组DNA为模板，利用上述引物组合进行PCR反应检测；(3)若在特异性分子标记位点只检测到碱基T，则判定待检水稻样品带有CTB4a基因；若只检测到碱基C，则判定待检水稻样品为带有CTB4a的等位基因；若同时检测到碱基T和C，则判定待检水稻样品为杂合基因型；若既检测不到碱基T也检测不到碱基C，则判定待检水稻样品既不带有CTB4a基因也不带有CTB4a的等位基因。步骤(2)中PCR检测反应条件为：预变性，95℃，5min；然后进行循环扩增反应，95℃40sec，55℃30sec，72℃50sec，共35个循环；最后72℃延伸10min；反应完成后利用HEX、FAM和ROX三通道荧光扫描酶标仪检测PCR扩增产物的荧光信号强度，读取的结果会转化成图形。本专利技术提供了上述特异性分子标记在辅助鉴定水稻耐冷基因CTB4a中的应用。本专利技术提供了上述特异性分子标记或引物组合或含有该引物组合的试剂盒在水稻种质资源改良中的应用。本专利技术提供了上述的特异性分子标记或引物组合或含有该引物组合的试剂盒在培育具有耐冷能力水稻中的应用。本专利技术的有益效果本专利技术提供了一种用于检测水稻耐冷基因CTB4a的特异性分子标记，并提供了检测该分子标记所用的引物组，它们检测CTB4a基因位点特异性高，利用PCR检测技术可快速鉴定水稻品种中的CTB4a基因，能够克服传统育种鉴定方法检测周期长、需要丰富经验的缺点。本专利技术提供的特异性分子标记的应用方法操作方便，检测结果准确可靠，可用于水稻CTB4a基因的鉴定及辅助育种，能够解决传统选育的效率低和周期长的难题。附图说明图1.41份水稻品种耐冷基因CTB4a的检测结果图具体实施方式以下实施例进一步说明本专利技术的内容，但不应理解为对本专利技术的限制。在不背离本专利技术精神和实质的情况下，对本专利技术方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本专利技术的范围。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1水稻耐冷基因CTB4a的特异性分子标记开发和引物设计根据耐冷亲本昆明小白谷水稻的耐冷基因CTB4a序列与水稻品种9311相对应基因组区域的CTB4a基因序列对比找到的差异片段，筛选出特异性好分子标记，从中挑选出SNP2063，SNP2063在CTB4a编码区区域存在一个T/C差异。用Primer6.0设计检测上述分子标记的特异性引物组合，将此SNP转化成能通过PCR技术检测的分子标记，引物组合包括引物ctb4本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于检测水稻耐冷基因CTB4a的特异性分子标记，其特征在于，所述的特异性分子标记命名为SNP2063，分子标记多态性为T/C。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于检测水稻耐冷基因CTB4a的特异性分子标记，其特征在于，所述的特异性分子标记命名为SNP2063，分子标记多态性为T/C。


2.按照权利要求1所述的特异性分子标记，其特征在于，所述的特异性分子标记使用一组引物组合来检测，所述引物组合包括引物ctb4a-Ft、ctb4a-Fc和ctb4a-R，ctb4a-Ft的序列如SEQ.ID.NO.1所示，ctb4a-Fc的序列如SEQ.ID.NO.2所示，ctb4a-R的序列如SEQ.ID.NO.3所示。


3.用于检测权利要求1所述的特异性分子标记的引物组合，其特征在于，所述引物组合包括引物ctb4a-Ft、ctb4a-Fc和ctb4a-R，ctb4a-Ft的序列如SEQ.ID.NO.1所示，ctb4a-Fc的序列如SEQ.ID.NO.2所示，ctb4a-R的序列如SEQ.ID.NO.3所示。


4.含有权利要求3所述的引物组合的试剂或试剂盒属。


5.权利要求3所述的引物组合在检测水稻耐冷基因CTB4a中的应用。


6.按照权利要求5所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提取待测水稻基因组DNA；
(2)以待...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘开强，潘英华，邓国富，高利军，黄娟，卿东进，高菊，伍豪，
申请(专利权)人：广西壮族自治区农业科学院，
类型：发明
国别省市：广西;45