彩色大麦中P3G和C3G合成基因紧密连锁的CAPS分子标记制造技术

本发明专利技术涉及遗传分析技术领域，尤其涉及彩色大麦中P3G和C3G合成基因紧密连锁的CAPS分子标记，并提供了该分子标记的检测引物。本发明专利技术提供分子标记与与PBG.ant‑2H位点的遗传距离为0.0cM。因此能够更准确的筛选出具有P3G和C3G合成主效QTL的大麦品种或品系，将其应用于大麦育种的早代选择能够进一步的提高育种中筛选工作的准确性。

Caps molecular markers closely linked to P3G and C3G synthetic genes in colored barley

【技术实现步骤摘要】
彩色大麦中P3G和C3G合成基因紧密连锁的CAPS分子标记
本专利技术涉及遗传分析
，尤其涉及彩色大麦中P3G和C3G合成基因紧密连锁的CAPS分子标记。
技术介绍
彩色大麦富含花青素，对人类健康具有重要的潜在的价值，是功能食品和保健营养品开发的重要材料，而且其抗氧化性和抗突变作用不仅在大麦籽粒中可以检测到，在其发酵液中也能得到检测。研究表明，不同花青素的作用不同，保健价值也就不同，而不同颜色大麦甚至颜色相似的大麦的花青素组成都可能存在较大差异。芍药色素-3-葡萄糖苷(Peonidin-3-glucoside,P3G)和矢车菊素-3-葡萄糖苷(Cyanidin-3-glucoside,C3G)普遍存在的重要花青素成分。因此，针对P3G和C3G合成基因进行研究，对大麦的品质提高以及种质筛选或培育存在重大意义。与形态学鉴定和细胞学鉴定等方法相比，分子标记辅助选择具有操作简便，周期短，结果准确等优点。此前的研究中，发现了与彩色大麦中P3G和C3G合成基因紧密连锁的的InDel标记，虽然InDel标记的检测方法比较简单，此前筛选获得的InDel标记离QTL的距离较远，而后续研究中并没有发现与主效QTL的遗传距离更近的分子标记。CAPS(Cleavedamplifiedpolymorphicsequence)即酶切扩增多态性序列标记基于PCR扩增和限制性酶切技术，可以用来检测遗传群体内不同个体之间基因组同一位点发生的SNP位点，具有稳定性好、多态性高、分型系统简单的优点。但目前为止，尚未发现有关大麦P3G和C3G合成基因/遗传位点紧密连锁CAPS分子标记序列信息的报道。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术要解决的技术问题在于提供彩色大麦中P3G和C3G合成基因紧密连锁的CAPS分子标记，该标记与PBG.ant-2H位点的遗传距离为0.0cM。本专利技术提供了大麦P3G和C3G合成主效QTLPBG.ant-2H紧密连锁的CAPS分子标记，其核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。本专利技术所述的彩色大麦籽粒P3G和C3G合成主效QTL为PBG.ant-2H，基于栽培大麦Hordeumvulgarecv.Morex和野生大麦AWCS079的基因组信息，在PBG.ant-2H附近发现一个与花青素合成相关的基因Ra，且该基因在两个亲本间存在可以设计CAPS的SNP位点，据此对紫色大麦RUSSIA68、无色大麦Gairdner做进一步研究。本专利技术以GAa1代表亲本Gairdner中Ra基因片段，49a1代表亲本Russia68中Ra基因片段，并以亲本49a1中的序列为SEQIDNO:1。在SEQIDNO:1中存在两个SNP位点，分别位于第170bp(T/C)和第781bp(G/A)。其中，位于第170bp的SNP位点处存在一个回文序列(167～172bp)，其为限制性内切酶MfeI的酶切位点，当该位点的基因型为T，则可以被MfeI酶切，当该位点基因型为C则无法被酶切。因此，扩增SEQIDNO:1所示的片段，经限制性内切酶MfeI裂解及电泳检测，利用标记BACS2H的引物可以扩增出高特异性片段，且经限制性内切酶MfeI裂解后，产生在两个亲本中具有显著带型差异。本专利技术还提供了检测所述分子标记的引物组，其由SEQIDNO:2～3所示核苷酸序列的2条引物组成。本专利技术提供的分子标记、检测引物及检测方法可应用于大麦育种的早代选择，并在大麦植株生长的早期进行检测(很多大麦材料籽粒颜色的遗传具有母体效应，且其籽粒颜色要在开花几十天后才能观测到，实验周期长)，能够极大减轻育种筛选的工作量，缩短育种周期，加快育种速度，降低育种成本，具有操作简单，成本低廉，周期短的优点。本专利技术所述的引物组在引物组在彩色大麦育种中的应用。与PBG.ant-2H紧密连锁的CAPS分子标记的有和无真正地直接地决定了两种花青素的含量的有无或高低。通过本专利技术分子标记检测可以鉴定这个遗传位点的有或无。所述彩色大麦育种为根据扩增后酶切的结果，判断PBG.ant-2H遗传位点紧密连锁的分子标记的存在与否，进而预测大麦种粒中花青素P3G和C3G的含量的有无或高低。大麦籽粒中的花青素P3G和C3G合成主效QTL检测试剂盒，包括本专利技术所述的引物组。所述试剂盒中还包括限制性内切酶MfeI。所述试剂盒中还包括marker；所述marker中包括2个DNA分子，长度依次为1496bp、1329bp和167bp。本专利技术所述的试剂盒中还包括PCR扩增试剂。所述PCR扩增试剂包括dNTP、MgCl2和Taq聚合酶。本专利技术所述的试剂盒中还包括酶切缓冲液，所述酶切缓冲液为MfeI的缓冲液，其包括Tris-HCl，MgCl2、NaCl、DTT和BSA。本专利技术还提供了一种大麦籽粒中的花青素P3G和C3G合成主效QTL检测方法，其包括：以大麦叶片基因组DNA为模板，以权利要求3所述的引物组进行PCR扩增，以限制性内切酶MfeI对扩增产物进行酶切，根据酶切产物判断大麦籽粒中的花青素P3G和C3G合成主效QTL的有无。本专利技术实施例中，所述大麦叶片为大麦的幼嫩叶片。具体为大麦植株生长早期的叶片。所述基因组DNA的提取方法为CTAB法。本专利技术实施例中，每25μL所述PCR扩增的体系包括：水和10～100ng基因组DNA、0.4μmol/L正向引物、0.4μmol/L反向引物、3mmol/LMgCl2，1mmol/LdNTPs和2.5UTaqDNA聚合酶，本专利技术实施例中，所述PCR扩增的程序为：本专利技术实施例中，所述判断为：所述酶切产物中片段数量为3，则该植株中存在PBG.ant-2H，且控制大麦籽粒中P3G和C3G合成的遗传位点为为杂合型；所述酶切产物中片段数量为1，则该植株存在PBG.ant-2H，且控制大麦籽粒中P3G和C3G合成的遗传位点为纯合型；所述酶切产物中片段数量为2，不存在与大麦籽粒中花青素P3G和C3G合成的主效QTL。通过本专利技术分子标记检测可以鉴定所述PBG.ant-2H遗传位点的有或无，进而判断大麦籽粒中两种花青素的含量的有无或高低。本专利技术提供了大麦P3G和C3G合成主效QTL紧密连锁的CAPS分子标记，并提供了该分子标记的检测引物。本专利技术提供分子标记与与PBG.ant-2H位点的遗传距离为0.0cM。因此能够更准确的筛选出具有P3G和C3G合成主效QTL的大麦品种或品系，将其应用于大麦育种的早代选择能够进一步的提高育种中筛选工作的准确性。附图说明图1示基于亲本间PBG.ant-2H附近花青素相关基因Ra的SNP设计出BACS2H，其中GAa1代表亲本Gairdner中Ra基因片段，49a1代表亲本Russia68中Ra基因片段；图2示BACS2H亲本间多态性检测结果，其中M代表DNA分子量标准DL5000，G代表亲本Gairdner，R代表亲本Russia68；图3示利用BACS2H标记本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.大麦P3G和C3G合成主效QTL PBG.ant-2H紧密连锁的CAPS分子标记，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。/n

【技术特征摘要】
1.大麦P3G和C3G合成主效QTLPBG.ant-2H紧密连锁的CAPS分子标记，其核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。


2.检测权利要求1所述分子标记的引物组，其特征在于，由SEQIDNO:2～3所示核苷酸序列的2条引物组成。


3.权利要求2所述的引物组在彩色大麦育种中的应用。


4.大麦籽粒中的花青素P3G和C3G合成主效QTL检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求3所述的引物组。


5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，其中还包括限制性内切酶MfeI。


6.根据权利要求4或5所述的试剂盒，其特征在于，其中还包括marker；所述marker中包括3个DNA分子，长度依次为1496bp、1329bp和167bp。


7.一种大麦籽粒...

【专利技术属性】
技术研发人员：张晓伟，刘春吉，梅时勇，刘淳劼，
申请(专利权)人：中国农业科学院麻类研究所，
类型：发明
国别省市：湖南;43