药品质量控制中常见产毒真菌的特征序列鉴定方法技术

本发明专利技术公开了一种药品质量控制中常见产毒真菌的特征序列鉴定方法，采用的特征序列为ITS和LSU，它们的扩增引物对序列分别如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3～SEQ ID NO.4所示。本发明专利技术采用的特征序列长度适中，符合特征序列的长度要求；通用性好，可以适用于常见产毒真菌；区分度强，能有效区分真菌在“属”或“种”水平的序列差异；准确性高，两段特征序列不仅可以分别用于真菌鉴定，同时两段特征序列联用的方式还可以进一步提高菌株的鉴定水平，结果稳定可靠。综上所述，本发明专利技术提供常见产毒真菌的特征序列鉴定方法为药品质量控制提供了有效且适用范围广的真菌鉴定方法。

Identification method of characteristic sequence of common poisonous fungi in drug quality control

【技术实现步骤摘要】
药品质量控制中常见产毒真菌的特征序列鉴定方法
本专利技术涉及真菌鉴定领域，尤其涉及药品质量控制中常见产毒真菌的特征序列鉴定方法。
技术介绍
医药产业发展迅速，相关产品发生微生物污染的事件也在增加，污染微生物不仅包括细菌也包括真菌，其中部分真菌还会产生毒性强烈的真菌毒素，因此一旦发生真菌污染尤其是产毒真菌污染会对药品质量以及患者的用药安全造成极大风险。为控制药品质量，避免对患者的健康造成危害，《中国药典》(2015年版)、《美国药典》(USP41)、《欧洲药典》(EP9.0)和《日本药典》(JP17)规定需要检查药品中金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌等致病菌，同时明确除限度标准中所列的致病菌外，其他具有潜在危害的微生物也需检查和评估。因此药品生产和检验过程中分离的致病菌需被准确鉴定。同时通过对中药材和饮片中产毒真菌的检测、鉴定，能从源头上提示真菌毒素存在的可能性，避免不合格药材饮片流入生产、使用环节，对提升药材饮片及中药制剂的安全性具有更为突出的效果。相对于细菌，真菌形态简单，传统的形态鉴定难度大。采用分子生物学方法对真菌进行鉴定，结果将更加准确。利用特征核酸片段进行分子鉴定已成为分子生物学研究的热点，该技术通过选择一段公认、易扩增、且相对较短的DNA片断，以核酸测序技术为基础，以不同微生物核酸序列的差异实现对微生物进行经济、快捷、准确的鉴定。现有特征序列的鉴定方法的研究主要对真菌的某一个属或特定某一类别进行鉴定，特征序列的种类比较多且繁杂，尚无征对药品领域常见产毒真菌的系统特征序列鉴定方法。为了实现对药材中产毒真菌的快速准确鉴定和真菌毒素的早期风险预警，需要一种药品质量控制中真菌的特征序列鉴定方法。
技术实现思路
本专利技术为解决现有技术中的上述问题提出的药品质量控制中常见产毒真菌的特征序列鉴定方法，该方法提供的两种特征序列广谱性好，既可以分别进行鉴定而且可以联合使用，不必要研究更换其他特征序列，具备操作简单，鉴定准确的特点，适用于药品质量控制中常见的所有产毒真菌鉴定，适用性强。为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：本专利技术的第一个方面是提供一种药品质量控制中常见产毒真菌的特征序列鉴定方法，采用的特征序列为ITS和LSU。进一步地，ITS特征序列的扩增引物序列如SEQIDNO.1～SEQIDNO.2所示；正向引物(ITS5F)：5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′(SEQIDNO.1)；反向引物(ITS4R)：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′(SEQIDNO.2)。进一步地，LSU特征序列的扩增引物序列如SEQIDNO.3～SEQIDNO.4所示；正向引物(LSUF)：5′-ACCCGCTGAACTTAAGC-3′(SEQIDNO.3)；反向引物(LSUR)：5′-TCCTGAGGGAAACTTCG-3′(SEQIDNO.4)。进一步地，该方法包括如下步骤：步骤一，对菌株进行分离纯化；步骤二，提取核酸：取菌体置于离心管中，研磨，然后加入CTAB缓冲液和2-巯基乙醇；水浴0.5-1.5h，然后加入饱和苯酚-氯仿-异戊醇溶液，充分颠倒混匀，-20℃冰箱放置；室温离心，取上清液置于新的离心管中；若上清液混浊，可再加入等体积饱和苯酚-氯仿-异戊醇溶液，室温离心，取上清液置于新的离心管中；再加入等体积的异丙醇溶液，颠倒使之充分混匀，室温放置2～3分钟，室温离心，弃上清；漂洗并风干加入TE缓冲液，混匀后作为核酸提取溶液(模板DNA)，置4℃冰箱中备用。步骤三，扩增特征序列；步骤四，检测核酸扩增产物：采用琼脂糖凝胶电泳法检测核酸扩增产物；步骤五，纯化核酸扩增产物：将步骤四中获得的琼脂糖凝胶中的核酸扩增产物切下，置于离心管中，加入TE缓冲液，水浴至凝胶块完全溶解；分别加入乙酸钠溶液和乙二胺四乙酸二钠溶液，混匀；加入无水乙醇，静置；离心，弃去上清液；加入适量75％乙醇(v/v)溶液洗涤，离心，弃去上清液，室温风干至乙醇挥发完全；加入50～200μl的TE缓冲溶液溶解，作为核酸扩增产物的纯化溶液，置4℃冰箱中备用；步骤六，对核酸进行测序和比对分析序列：以步骤五获得的扩增引物作为测序引物，使用核酸测序仪对纯化后的核酸扩增产物进行双向测序，获得目标核酸序列，双向测序峰图采用有峰图拼接功能的软件，以正、反向核酸序列叠加的方式进行序列拼接，并去除两端引物区序列；将获得的真菌DNA特征序列进行比对分析，得到判定结果。进一步地，步骤二中的CTAB缓冲液的组成成分包括50mmol/LTris-HClpH8，0.7mol/LNaCl，10mmol/LEDTApH8和2％CTAB。进一步地，步骤二中的苯酚-氯仿-异戊醇溶液中的苯酚、氯仿和异戊醇的体积比为25：24：1。进一步地，步骤二中离心所采用的转速为每分钟12000转。进一步地，步骤三中的扩增体系包括：PCR反应缓冲液2.5μl，脱氧核糖核苷三磷酸(dNTPs，2.5mmol/L)2μl，正向和反向引物(2.5μmol/L)各2μl，模板DNA1μl，TaqDNA聚合酶(1U/μl)1μl，加灭菌的纯化水至25μl。进一步地，步骤三中的扩增程序为94℃预变性10分钟；94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸30秒，29个循环；72℃继续延伸5分钟。进一步地，步骤四中采用的琼脂糖凝胶中加入的核酸凝胶染色剂为溴化乙锭或吖啶橙。本专利技术采用上述技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：本专利技术采用的特征序列长度适中，符合特征序列的长度要求；通用性好，可以适用于常见产毒真菌；区分度强，能有效区分真菌在“属”或“种”水平的序列差异；准确性高，两段特征序列不仅可以分别用于真菌鉴定，同时两段特征序列联用的方式还可以进一步提高菌株的鉴定水平，结果稳定可靠。附图说明图1为本专利技术一实施例中代表性菌株特征序列的电泳图；图2为本专利技术一实施例中产毒真菌ITS特征序列的进化分析图；图3为本专利技术一实施例中产毒真菌LSU特征序列的进化分析图；图4为本专利技术一实施例中产毒真菌ITS和LSU特征序列联用的进化分析图。具体实施方式本专利技术提供了一种药品质量控制中常见产毒真菌的特征序列鉴定方法。下面通过具体实施例对本专利技术进行详细和具体的介绍，以使更好的理解本专利技术，但是下述实施例并不限制本专利技术范围。以下实施例中采用的仪器包括ABI3500核酸测序仪(ABI公司)、琼脂糖凝胶电泳仪(Bio-Rad公司)、凝胶成像系统(Bio-Rad公司)、光学显微镜(Zeiss公司)、核酸浓度测定仪(Eppendorf公司)等。采用的菌株如表1所示。表1真菌菌株列表实施例一本专利技术提供测定8个属30余种真菌的特征序列鉴定方法，其中采用的真菌的种类如表1所示，具体的鉴定步骤如下：步本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种药品质量控制中常见产毒真菌的特征序列鉴定方法，其特征在于，所述特征序列为ITS特征序列和LSU特征序列。/n

【技术特征摘要】
1.一种药品质量控制中常见产毒真菌的特征序列鉴定方法，其特征在于，所述特征序列为ITS特征序列和LSU特征序列。


2.根据权利要求1所述的药品质量控制中常见产毒真菌的特征序列鉴定方法，其特征在于，所述ITS特征序列的扩增引物序列如SEQIDNO.1～SEQIDNO.2所示。


3.根据权利要求1所述的药品质量控制中常见产毒真菌的特征序列鉴定方法，其特征在于，所述LSU特征序列的扩增引物序列如SEQIDNO.3～SEQIDNO.4所示。


4.根据权利要求1所述的药品质量控制中常见产毒真菌的特征序列鉴定方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一，对菌株进行分离纯化；
步骤二，提取核酸：取步骤一中的纯化后的菌株置于离心管中，研磨，然后加入CTAB缓冲液和2-巯基乙醇；水浴0.5-1.5h，然后加入饱和苯酚-氯仿-异戊醇溶液，充分颠倒混匀，-20℃冰箱放置；室温离心，取上清液置于新的离心管中；若上清液混浊，可再加入等体积饱和苯酚-氯仿-异戊醇溶液，室温离心，取上清液置于新的离心管中；再加入等体积的异丙醇溶液，颠倒使之充分混匀，室温放置2～3分钟，室温离心，弃上清；漂洗并风干加入TE缓冲液，混匀后作为核酸提取溶液，即模板DNA，置4℃冰箱中备用；
步骤三，扩增步骤二得到的模板DNA的特征序列；
步骤四，检测核酸扩增产物：采用琼脂糖凝胶电泳法检测步骤三得到的核酸扩增产物；
步骤五，纯化核酸扩增产物：将步骤四中获得的琼脂糖凝胶中的核酸扩增产物切下，置于离心管中，加入TE缓冲液，水浴至凝胶块完全溶解；分别加入乙酸钠溶液和乙二胺四乙酸二钠溶液，混匀；加入无水乙醇，静置；离心，弃去上清液；加入适量75％乙醇溶液洗涤，离心，弃去上清液，室温风干至乙醇挥发完全；加入50～200μl的TE缓冲溶液溶解，作为核酸扩增产物的纯化溶液，置4℃...

【专利技术属性】
技术研发人员：蒋波，冯震，杨美成，刘浩，秦峰，缪天瑶，
申请(专利权)人：上海市食品药品检验所，
类型：发明
国别省市：上海;31