一种基于双标记信号放大的间接背景荧光胶体金免疫层析试纸条及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种基于双标记信号放大的间接背景荧光胶体金免疫层析试纸条及其应用。所述试纸条包括铺有荧光的PVC塑料背板、PVC底板、硝酸纤维素膜、样品垫和吸水纸五部分。本发明专利技术还公开了双标记胶体金探针，所述双标记胶体金探针是由金纳米颗粒标记的生物素化的抗目标物的抗体和金纳米颗粒标记的链霉亲和素组成，利用生物素‑链霉亲和素分子之间超强的亲和力实现信号放大。本发明专利技术的荧光胶体金免疫层析试纸条在检测前利用免疫磁性微球对样本进行前处理，在外加磁场中可高效快速分离富集目标物。本发明专利技术试纸条稳定性好，灵敏度高，不受基质干扰，能够实现对样本的快速定性或定量检测，且操作步骤简便、可控性强，具有良好的应用前景。

An indirect background fluorescent colloidal gold immunochromatographic strip based on double labeled signal amplification and its application

【技术实现步骤摘要】
一种基于双标记信号放大的间接背景荧光胶体金免疫层析试纸条及其应用
本专利技术属于食品安全检测和生物医学
，具体涉及一种基于双标记信号放大的间接背景荧光胶体金免疫层析试纸条及其应用。
技术介绍
随着我国加入世贸组织，人们对食品由需求型逐步向质量型转变。有害物质残留问题已成为世界各国食品安全检测的重要指标，我国政府虽然也制定了一系列法律法规和技术标准限制有害物质残留的标准，但加强残留检测，建立残留检测体系，向社会提供安全卫生的食品，保护人类健康势在必行。目前对有害物质残留的检测主要是利用仪器和快速检测试纸条等方法。仪器方法主要有气相色谱法、气相色谱-质谱联用法、高效液相色谱及液相色谱-质谱联用法，由于仪器方法价格高昂，检测人员技术要求过高，检测过程繁琐，操作不易推广等限制，使得简便、低廉、快速的免疫层析技术发展迅猛，在食品安全、医学诊断、环境监测等领域得到了广泛的应用。其中，基于胶体金为标记物的免疫层析技术是运用最成功最广泛的一种快速筛查手段，但因不同地区、品种、时间的样本中基质干扰较为严重，使得检测试纸条的准确度，重复性不容乐观；而且试纸条检测结果的稳定性，灵敏度仍然有待改进。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种试剂盒。本专利技术提供的试剂盒包括试纸条和双标记胶体金探针；所述双标记胶体金探针由金纳米颗粒标记的生物素化的抗目标物的抗体和金纳米颗粒标记的链霉亲和素组成；所述试纸条由依次连接并固定于基底层上的样品垫、设有检测线和质控线的包被膜，以及吸水垫组成；所述包被膜与所述基底层之间设有荧光背板；所述检测线和所述质控线相互分离；所述检测线处包被有目标物抗原；所述抗目标物的抗体能够特异性结合所述目标物抗原；所述质控线处包被有抗所述抗目标物的抗体的抗体；所述检测线位于所述包被膜靠近所述样品垫的一端；所述质控线位于所述包被膜靠近所述吸水垫的一端。上述试剂盒中，所述金纳米颗粒标记的生物素化的抗目标物的抗体中，所述金纳米颗粒与生物素化的抗目标物的抗体的质量比可为(300～1000)：1；具体可为500：1。所述金纳米颗粒标记的链霉亲和素中，所述金纳米颗粒与链霉亲和素的质量比可为(50～500)：1；具体可为100：1。所述抗目标物的抗体为抗目标物的单克隆抗体或多克隆抗体。所述检测线处包被有目标物抗原与BSA载体蛋白的偶联物。所述金纳米颗粒标记的生物素化的抗目标物的抗体的制备方法如下：m1)生物素化抗目标物的抗体溶液的制备：将氨基化生物素加入到抗目标物的抗体溶液中，反应1h后用透析膜透析，然后从透析袋中吸出生物素化抗体，并用PBS溶液调整生物素化抗体的浓度，得到所述生物素化抗目标物的抗体溶液。m2)金颗粒溶液的制备：取去离子水置于锥形瓶中煮沸，加入氯金酸溶液和柠檬酸三钠溶液，继续煮沸，当颜色变为酒红色时冷却至室温，得到所述金颗粒溶液。m3)将所述生物素化抗目标物的抗体溶液加入到所述金颗粒溶液中，室温孵育，然后用BSA溶液作为封闭液，室温封闭。m4)高速离心除去游离未结合的生物素化抗目标物的抗体，然后用重悬液进行重悬，得到所述金纳米颗粒标记的生物素化的抗目标物的抗体。所述金纳米颗粒标记的链霉亲和素的制备方法如下：n1)将链霉亲和素加入所述金颗粒溶液中，边加边搅拌，之后立刻加入NaHCO3溶液，室温孵育10min，然后用PEG6000稳定金纳米颗粒。n2)离心除去游离未结合的链霉亲和素，然后用重悬液进行重悬，得到所述金纳米颗粒标记的链霉亲和素。进一步地，所述抗目标物的抗体为抗目标物的单克隆抗体；所述抗所述抗目标物的抗体的抗体为羊抗鼠IgG；所述金纳米颗粒的粒径为30nm；所述基底层的材料为聚氯乙烯；所述荧光背板为表面喷涂有荧光的PVC塑料板；所述样品垫为玻璃纤维素膜；所述包被膜为硝酸纤维素膜；所述检测线与所述质控线之间的距离为3mm。本专利技术另一个目的是提供上述试剂盒的制备方法。本专利技术提供的上述试剂盒的制备方法包括如下步骤：分别制备上述试剂盒中的试纸条和双标记胶体金探针；制备所述试纸条的方法包括如下步骤：I、分别制备所述样品垫、所述设有检测线和质控线的包被膜，以及所述吸水垫；II、在所述基底层的中部覆盖所述荧光背板，然后将步骤I得到的设有检测线和质控线的包被膜覆盖在所述荧光背板上，再将步骤I得到的所述样品垫和步骤I得到的所述吸水垫分别依次搭接于所述包被膜的两端，得到所述试纸条；所述设有检测线和质控线的包被膜按照如下方法制备：将上述目标物抗原和上述羊抗鼠IgG分别喷涂在所述包被膜的检测线区域和质控线区域，形成所述检测线和所述质控线，得到所述设有检测线和质控线的包被膜；制备所述双标记胶体金探针的方法为上述金纳米颗粒标记的生物素化的抗目标物的抗体和金纳米颗粒标记的链霉亲和素的制备方法。本专利技术又有一个目的是提供上述试剂盒或上述制备方法的新用途。本专利技术提供了上述试剂盒或上述制备方法在检测目标物中的应用。本专利技术还提供了上述试剂盒或上述制备方法在检测待测样本中是否含有目标物中的应用。本专利技术还提供了上述试剂盒或上述制备方法在检测待测样本中目标物含量中的应用。本专利技术还有一个目的是提供一种检测待测样本中是否含有目标物的方法。本专利技术提供的检测待测样本中是否含有目标物的方法包括如下步骤：(c1)将待测样本用免疫磁性微球进行富集，得到富集后的样本；(c2)向富集后的样本中加入权利要求1-3中任一所述的双标记胶体金探针，得到混合溶液；(c3)将所述混合溶液孵育3min，然后加入上述试纸条的样品垫上，层析10min后，观察检测线和质控线的显色情况；若C线和T线均显红色，则所述待测样本中不含有目标物或候选不含有目标物；若C线显红色，T线不显色，则所述待测样本中含有目标物或候选含有目标物。在实际应用中，若待测样本中没有目标物，只有固定化的目标物抗原与GNPs-mAb-生物素化合物反应，则T和C两条线都会呈现红色；相反，若待测样本中有目标物，则目标物与分布于硝酸纤维素膜上的目标物抗原发生竞争性结合。因此，样品中目标物含量越多，T线的颜色越来越淡。本专利技术还有一个目的是提供一种检测待测样本中目标物含量的方法。本专利技术提供的检测待测样本中目标物含量的方法包括如下步骤：(d1)绘制标准曲线配制系列浓度的目标物标准品溶液，将所得的若干份含有不同浓度的标准品溶液分别用免疫磁性微球进行富集，得到富集后的样本；将所述富集后的样本分别与上述双标记胶体金探针混匀，得到混合溶液；将所述混合溶液孵育3min，然后加入上述试纸条的样品垫上，层析10min后，使用荧光读取仪测定空白背板的荧光强度和T线的荧光强度；以所述目标物的标准品溶液的浓度为横坐标，以所述空白背板的荧光强度和所述T线的荧光强度的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种试剂盒，其包括试纸条和双标记胶体金探针；/n所述双标记胶体金探针由金纳米颗粒标记的生物素化的抗目标物的抗体和金纳米颗粒标记的链霉亲和素组成；/n所述试纸条由依次连接并固定于基底层上的样品垫、设有检测线和质控线的包被膜，以及吸水垫组成；所述包被膜与所述基底层之间设有荧光背板；/n所述检测线和所述质控线相互分离；/n所述检测线处包被有目标物抗原；所述抗目标物的抗体能够特异性结合所述目标物抗原；/n所述质控线处包被有抗所述抗目标物的抗体的抗体；/n所述检测线位于所述包被膜靠近所述样品垫的一端；/n所述质控线位于所述包被膜靠近所述吸水垫的一端。/n

【技术特征摘要】
1.一种试剂盒，其包括试纸条和双标记胶体金探针；
所述双标记胶体金探针由金纳米颗粒标记的生物素化的抗目标物的抗体和金纳米颗粒标记的链霉亲和素组成；
所述试纸条由依次连接并固定于基底层上的样品垫、设有检测线和质控线的包被膜，以及吸水垫组成；所述包被膜与所述基底层之间设有荧光背板；
所述检测线和所述质控线相互分离；
所述检测线处包被有目标物抗原；所述抗目标物的抗体能够特异性结合所述目标物抗原；
所述质控线处包被有抗所述抗目标物的抗体的抗体；
所述检测线位于所述包被膜靠近所述样品垫的一端；
所述质控线位于所述包被膜靠近所述吸水垫的一端。


2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：
所述金纳米颗粒标记的生物素化的抗目标物的抗体中，所述金纳米颗粒与生物素化的抗目标物的抗体的质量比为(300～1000)：1；
或，所述金纳米颗粒标记的链霉亲和素中，所述金纳米颗粒与链霉亲和素的质量比为(50～500)：1；
或，所述抗目标物的抗体为抗目标物的单克隆抗体或多克隆抗体。


3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于：
所述抗目标物的抗体为抗目标物的单克隆抗体；
或，所述抗所述抗目标物的抗体的抗体为羊抗鼠IgG；
或，所述金纳米颗粒的粒径为30nm；
或，所述基底层的材料为聚氯乙烯；
或，所述荧光背板为表面喷涂有荧光的PVC塑料板；
或，所述样品垫为玻璃纤维素膜；
或，所述包被膜为硝酸纤维素膜；
或，所述检测线与所述质控线之间的距离为3mm。


4.权利要求1-3任一所述的试剂盒的制备方法，包括如下步骤：分别制备权利要求1-3任一所述的试剂盒中的试纸条和双标记胶体金探针；
制备所述试纸条的方法包括如下步骤：
I、分别制备所述样品垫、所述设有检测线和质控线的包被膜，以及所述吸水垫；
II、在所述基底层的中部覆盖所述荧光背板，然后将步骤I得到的设有检测线和质控线的包被膜覆盖在所述荧光背板上，再将步骤I得到的所述样品垫和步骤I得到的所述吸水垫分别搭接于所述包被膜的两端，得到所述试纸条；
所述设有检测线和质控线的包被膜按照如下方法制备：将权利要求1-3中所述的目标物抗原和权利要求1-3中所述的羊抗鼠IgG分别喷涂在所述包被膜的检测线区域和质控线区域，形成所述检测线和所述质控线，得到所述设有检测线和质控线的包被膜；
制备所述双标记胶体金探针的方法为权利要求1-3中所述的金纳米颗粒标记的生物素化的抗目标物的抗体和金纳米颗粒标记的链霉亲和素的制备方法。


5.权利要求1-3任一所述的试剂盒或权利要求4所述的制备方法在检测目标物中的应用；
或，权利要求1-3任一所述的试剂盒或权利要求4所述的制备方法在检测待测样本中是否含有目标物中的应用；
或，权利要求1-3任一所述的试剂盒...

【专利技术属性】
技术研发人员：江海洋，沈建忠，郑丕苗，吴聪明，丁双阳，王战辉，柯跃斌，温凯，曾于洋，梁德媚，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：北京;11