一种端基为谷氨酸的呈鲜多肽表面分子印迹聚合物硅胶微球的制备方法及应用技术

本发明专利技术涉及一种端基为谷氨酸的呈鲜多肽的表面分子印迹聚合物硅胶微球的制备方法，包括步骤：采用稀盐酸浸泡法，对硅胶微球表面进行除杂处理，得到活化硅胶微球；对活化硅胶微球进行表面硅烷化改性，得到硅烷化硅胶微球；对硅烷化硅胶微球进行RAFT功能化处理，得到表面接枝双硫酯键的RAFT功能化硅胶微球；替代模板分子、金属离子和功能单体自组装后，加入交联剂、引发剂以及RAFT功能化硅胶微球，通过RAFT聚合反应，得到表面包覆有替代模板分子的分子印迹涂层微球；洗脱除去表面包覆的替代模板分子；其中，所述替代模板分子为L‑谷氨酸，所述金属离子为Cu

Preparation and application of molecularly imprinted polymer microsphere with glutamic acid as terminal group on the surface of fresh polypeptide

【技术实现步骤摘要】
一种端基为谷氨酸的呈鲜多肽表面分子印迹聚合物硅胶微球的制备方法及应用
本专利技术属于化学分析测试领域，尤其涉及一种端基为谷氨酸的呈鲜多肽表面分子印迹聚合物硅胶微球的制备方法和应用。
技术介绍
酱油是我国传统的酿造制品，是老百姓日常生活中不可或缺的调味品。独特的色、香、味使其成为深受我国人民喜爱的传统调味品。而鲜味是酱油中最重要的评价指标。人们发现酿造酱油中存在一类分子量在500Da以下的小分子多肽，这些小分子多肽能够显著提高食品整体鲜味强度，是酿造酱油中的风味物质，人们称这些小分子多肽为呈鲜多肽。经研究发现，大多数的呈鲜多肽是端基氨基酸为谷氨酸或天冬氨酸的二肽和三肽。借此，人们可以通过检测和分析酿造酱油中的呈鲜多肽的种类和含量，进一步揭示和掌握酱油的呈鲜机理。目前，对于呈鲜多肽的分析方法主要为液相色谱法和液相色谱/质谱法。此两种方法均需先对样品溶液，即酱油进行预处理。而针对氨基酸、小分子多肽和蛋白质的分离和检测的样品预处理技术中，表面印迹技术作为一种新型的样品预处理技术，受到愈来愈广泛地关注。表面印迹技术的作用原理类似于酶-底物的“钥匙-锁”相互作用原理，以硅胶等材料作为支撑固相，以目标分子作为模板分子，通过化学反应生成相应地化学键将模板分子结合在支撑固相上，然后通过洗脱等手段将模板分子脱去，从而在支撑固相表面留出一个空位用于结合目标分子。由于模板分子与目标分子相同，因此，支撑固相表面留出的结合空位，只能特异性吸附结合目标分子，从而大大地提高了对样品溶液中目标分子的选择性，降低了与样品溶液中其他分子结合的概率，从而大大提高了检测的准确率。在该项技术中，我们将已经洗脱掉模板分子，留有支撑固相和表面目标分子结合空位的结构称为表面分子印迹聚合物。可以看出，表面印迹技术只需将样品溶液与表面分子印迹聚合物接触，即可完成样品溶液中目标分子的结合分离，操作十分简便且耗时少。但现有技术中，用于检测氨基酸和多肽的表面分子印迹聚合物存在包覆不均匀、厚度不均一、性能不稳定等缺点。并且，现有的表面分子印迹聚合物的制备方法中，主要通过分子间作用力将模板分子结合到支撑固相上，由于分子间作用力十分微弱，因此结合到支撑固相上的模板分子数量有限，相应地所形成的结合空位数量也有限，使得所制得表面分子印迹聚合物不能够尽量多的或者完全吸附结合样品溶液中的目标分子，从而影响了检测的准确性。另外，现有技术中尚未将表面印迹技术应用于呈鲜多肽的检测和分析。
技术实现思路
基于此，本专利技术提供一种端基为谷氨酸的呈鲜多肽表面分子印迹聚合物硅胶微球的制备方法，以制备得到包覆均匀、厚度均一、性能稳定、能够同时特异性吸附多种端基为L-谷氨酸的呈鲜多肽分子、以及硅胶微球与模板分子之间的化学键更加牢固的表面分子印迹聚合物。本专利技术的端基为谷氨酸的呈鲜多肽的表面分子印迹聚合物硅胶微球的制备方法，包括以下步骤：S1：采用稀盐酸浸泡法，对硅胶微球表面进行除杂处理，得到活化硅胶微球；S2：采用硅烷化试剂对活化硅胶微球进行表面硅烷化改性，得到硅烷化硅胶微球；S3：采用RAFT试剂对硅烷化硅胶微球进行RAFT功能化处理，得到表面接枝双硫酯键的RAFT功能化硅胶微球；S4：将替代模板分子、金属离子和功能单体于混合溶剂中充分混匀使替代模板分子、金属离子和功能单体自组装，然后加入交联剂、引发剂以及RAFT功能化硅胶微球，通过RAFT聚合反应，得到表面包覆有替代模板分子的分子印迹涂层微球；S5：洗脱步骤S4所得硅胶微球，除去其表面包覆的替代模板分子后，干燥得到表面分子印迹聚合物硅胶微球；其中，所述替代模板分子为L-谷氨酸，所述金属离子为Cu2+，所述功能单体为1-(N，N-双羧甲基)氨基-3-烯丙基甘油。相对于现有技术，利用本专利技术所述方法制备的表面分子印迹聚合物硅胶微球包覆均匀、印迹物分子量分布窄、性能稳定的优点。并且，由于多种呈鲜多肽的端基为L-谷氨酸，因此，一次性实现在水环境下对多种呈鲜多肽的选择性吸附，大大降低了工作量。另外，传统的表面分子印迹技术，功能单体与替代模板分子之间通过分子间作用力结合，本专利技术的制备方法中，金属离子Cu2+和功能单体1-(N，N-双羧甲基)氨基-3-烯丙基甘油通过金属螯合作用力连接替代模板分子L-谷氨酸，相对于分子间作用力，L-谷氨酸与Cu2+的结合力更强，能够更加稳定聚合物的表面，也能够结合更多的替代模板分子，从而得到更多的L-谷氨酸结合空位，以尽量多地甚至是全部结合酿造酱油中的端基为谷氨酸的呈鲜多肽，提高检测的准确性。进一步地，所述替代模板分子与功能单体的摩尔比为7:1～1:15；所述功能单体与金属离子的摩尔比为9:1～1:12。进一步地，所述交联剂为N,N-亚甲基双丙烯酰胺；所述引发剂为偶氮二异丁腈；所述引发剂的用量为交联剂质量的0.1％～5％。进一步地，所述硅烷化试剂为4-氯甲基苯基三甲氧基硅烷；所述的硅烷化试剂与活化硅胶微球的摩尔比为8:1～1:12。进一步地，步骤S1中，将硅胶微球置于质量分数为5％～20％的盐酸中，超声3～20min，并加热至50～200℃保持12～48h；然后用去离子水洗涤抽滤直至中性，干燥，在50～200℃下活化12～48h，得到活化硅胶微球。通过使用稀盐酸对硅胶微球表面进行活化，使得SiO2微球表面含有丰富的羟基，有利于后续的表面改性。进一步地，步骤S2中，将活化硅胶微球超声分散于无水甲苯中，通入氮气除氧，然后加入4-氯甲基苯基三甲氧基硅烷，于30～150℃反应12～48h；用甲苯、乙醇分别洗涤后，干燥，得到硅烷化硅胶微球。使用硅烷化试剂对SiO2微球进行硅烷化处理，使得微球表面连接活性硅烷基，而后续的RAFT试剂与功能单体-金属离子-替代模板分子自组装结构的替换，都是通过活性硅烷基连接在固相SiO2微球的表面。进一步地，步骤S3中，对四氢呋喃进行干燥和通氮除氧预处理后，将苯基溴化镁加入预处理的四氢呋喃中，然后逐滴加入CS2，在20～80℃条件下反应0.2～3h；之后加入硅烷化硅胶微球，超声均匀分散，通入氮气除氧3～30min，加热至30～80℃反应24～60h；反应结束，依次用四氢呋喃、甲醇、丙酮多次洗涤后，干燥，得到RAFT功能化硅胶微球。采用苯基溴化镁和二硫化碳在无氧条件下合成具有活性自由基的RAFT试剂，RAFT试剂能够结合到活性硅烷基团上，从而实现微球表面聚合物自主生长；且由于苯基溴化镁和二硫化碳均为小分子，其两者结合生成的RAFT试剂也为小分子，因此，所形成的印迹膜层厚度较薄；且由于是小分子，体积和长度较小，使得所占空间较小，不会挤压相邻活性硅烷基位点结合RAFT试剂的空间，因此，所形成的印迹膜层厚度较为均一；从而克服了常规自由基聚合法制备的MIP膜层厚度较薄且厚度的问题。进一步地，步骤S4中，将L-谷氨酸超声溶解于混合溶剂中，加入1-(N，N-双羧甲基)氨基-3-烯丙基甘油和Cu2+后，在10～80℃温度下震荡4～14h；之后向其中加入RAFT功能化硅胶微球、交联剂，超声分散后加入引发剂，振荡超本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种端基为谷氨酸的呈鲜多肽的表面分子印迹聚合物硅胶微球的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：/nS1：采用稀盐酸浸泡法，对硅胶微球表面进行除杂处理，得到活化硅胶微球；/nS2：采用硅烷化试剂对活化硅胶微球进行表面硅烷化改性，得到硅烷化硅胶微球；/nS3：采用RAFT试剂对硅烷化硅胶微球进行RAFT功能化处理，得到表面接枝双硫酯键的RAFT功能化硅胶微球；/nS4：将替代模板分子、金属离子和功能单体于混合溶剂中充分混匀使替代模板分子、金属离子和功能单体自组装，然后加入交联剂、引发剂以及RAFT功能化硅胶微球，通过RAFT聚合反应，得到表面包覆有替代模板分子的分子印迹涂层微球；/nS5：洗脱步骤S4所得硅胶微球，除去其表面包覆的替代模板分子后，干燥得到表面分子印迹聚合物硅胶微球；/n其中，所述替代模板分子为L-谷氨酸，所述金属离子为Cu

【技术特征摘要】
1.一种端基为谷氨酸的呈鲜多肽的表面分子印迹聚合物硅胶微球的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1：采用稀盐酸浸泡法，对硅胶微球表面进行除杂处理，得到活化硅胶微球；
S2：采用硅烷化试剂对活化硅胶微球进行表面硅烷化改性，得到硅烷化硅胶微球；
S3：采用RAFT试剂对硅烷化硅胶微球进行RAFT功能化处理，得到表面接枝双硫酯键的RAFT功能化硅胶微球；
S4：将替代模板分子、金属离子和功能单体于混合溶剂中充分混匀使替代模板分子、金属离子和功能单体自组装，然后加入交联剂、引发剂以及RAFT功能化硅胶微球，通过RAFT聚合反应，得到表面包覆有替代模板分子的分子印迹涂层微球；
S5：洗脱步骤S4所得硅胶微球，除去其表面包覆的替代模板分子后，干燥得到表面分子印迹聚合物硅胶微球；
其中，所述替代模板分子为L-谷氨酸，所述金属离子为Cu2+，所述功能单体为1-(N，N-双羧甲基)氨基-3-烯丙基甘油。


2.根据权利要求1所述的端基为谷氨酸的呈鲜多肽的表面分子印迹聚合物硅胶微球的制备方法，其特征在于：所述替代模板分子与功能单体的摩尔比为7:1～1:15；所述功能单体与金属离子的摩尔比为9:1～1:12。


3.根据权利要求2所述的端基为谷氨酸的呈鲜多肽的表面分子印迹聚合物硅胶微球的制备方法，其特征在于：所述交联剂为N,N-亚甲基双丙烯酰胺；所述引发剂为偶氮二异丁腈；所述引发剂的用量为交联剂质量的0.1％～5％。


4.根据权利要求3所述的端基为谷氨酸的呈鲜多肽的表面分子印迹聚合物硅胶微球的制备方法，其特征在于：所述硅烷化试剂为4-氯甲基苯基三甲氧基硅烷；所述的硅烷化试剂与活化硅胶微球的摩尔比为8:1～1:12。


5.根据权利要求1～4任意一条所述的端基为谷氨酸的呈鲜多肽的表面分子印迹聚合物硅胶微球的制备方法，其特征在于：步骤S1中，将硅胶微球置于质量分数为5％～20％的盐酸中，超声3～20min，并加热至50～200℃保持12～48h；然后用去离子水洗涤抽滤直至中性，干燥，在50～200℃下活化12～48...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡小刚，何佩玲，罗晓燕，郑雪屏，
申请(专利权)人：华南师范大学，
类型：发明
国别省市：广东;44