一种庆大霉素C1a的纯化方法技术

本发明专利技术公开了一种庆大霉素C1a的纯化方法。该方法包括如下步骤：(1)将庆大霉素发酵液依次经大孔吸附树脂层析、大孔弱酸性阳离子树脂层析，得层析液；或者，将庆大霉素发酵液依次经大孔弱酸性阳离子树脂层析、大孔吸附树脂层析，得层析液；(2)将步骤(1)中所述层析液的pH调至10.0‑12.0，经反相吸附树脂层析，得层析液C，将所述层析液C的pH调节至4.0‑8.0，即可；所述反相吸附树脂层析的流动相为pH 1.0‑2.0的酸水溶液，所述反相吸附树脂为聚苯乙烯二乙烯基苯系树脂。本发明专利技术的纯化方法操作简单、生产成本低，在保证收率大于41％的前提下，分离得到的庆大霉素C1a纯度大于96％。

A purification method of gentamicin C1a

【技术实现步骤摘要】
一种庆大霉素C1a的纯化方法
本专利技术涉及一种庆大霉素C1a的纯化方法。
技术介绍
1963年美国Schering公司的weiestein第一次从棘孢小单孢菌中分离得到庆大霉素(Gentamicin)。庆大霉素是为数不多的热稳定性氨基糖苷类碱性抗生素。性质稳定，溶于水，不溶于乙醇，丙酮等有机溶剂。广义上的庆大霉素是多组分的混合物，以C族复合物为主。主要从绛红小单孢菌、棘孢小单孢菌中发酵分离获得。其主要成分有C1，C1a，C2，C2a。因其优良的抗菌能力而被广泛使用。其中庆大霉素C1a作为依替米星的合成原料药物。庆大霉素C1a的传统获取是从小诺霉素发酵液副产物中获得，下游纯化一般通过脱色、过滤、浓缩、离子树脂吸附、洗脱、解析、浓缩喷雾干燥等过程。传统方法耗费的时间长，生产工艺复杂。离子树脂吸附后要经过多次洗脱和冲洗才能获得产物，原材料消耗大，生产成本高。庆大霉素C1a的新型获取通过改变菌种或发酵培养基和补料方式改变小单孢菌产生的庆大霉素各组分的比例(如专利201710791469.5)，特别是降低难去除副产物的比例，此法能显著提高下游纯化庆大霉素C1a的收率。纯化方面，除传统的离子交换树脂法外，专利201510998347.4通过连续色谱分离法用大孔吸附树脂分离纯化庆大霉素C1a，此方法虽然比传统的方法更易操作，但其纯化获得的样品纯度只大于90％，难以获得纯度大于98％的庆大霉素C1a。因此，在保证收率的前提下，如何分离纯化得到纯度较高的庆大霉素C1a是本领域亟待解决的问题。<br>
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题在于克服现有技术中庆大霉素C1a分离纯化方法复杂，在保证收率的前提下，难以提高其纯度的缺陷，而提供了一种庆大霉素C1a的纯化方法。本专利技术的纯化方法操作简单、生产成本低，在保证收率大于41％的前提下，分离得到的庆大霉素C1a纯度大于96％。本专利技术提供了一种庆大霉素C1a的纯化方法，其包括下述步骤：(1)将pH调整为10.0-12.0的庆大霉素发酵液经大孔吸附树脂层析，得层析液A1；将pH调整为6.0-8.0的层析液A1经大孔弱酸性阳离子树脂层析，得层析液A2；所述大孔吸附树脂层析的流动相为pH1.0-2.0的酸水溶液，所述大孔弱酸性阳离子树脂层析的流动相为pH11.0-12.0的氨水溶液；或者，将pH调整为6.0-8.0的庆大霉素发酵液经大孔弱酸性阳离子树脂层析，得层析液B1；将pH调整为10.0-12.0的层析液B1经大孔吸附树脂层析，得层析液B2；所述大孔弱酸性阳离子树脂层析的流动相为pH11.0-12.0的氨水溶液，所述大孔吸附树脂层析的流动相为pH1.0-2.0的酸水溶液；(2)将步骤(1)中所述层析液A2或所述层析液B2的pH调至10.0-12.0，经反相吸附树脂层析，得层析液C，将所述层析液C的pH调至4.0-8.0，即可；所述反相吸附树脂层析的流动相为pH1.0-2.0的酸水溶液，所述反相吸附树脂为聚苯乙烯二乙烯基苯系树脂。本专利技术中，庆大霉素C1a的收率是指经分离纯化后得到的庆大霉素C1a的质量占庆大霉素发酵液中庆大霉素C1a总质量的百分比。步骤(1)中，所述庆大霉素发酵液可为本领域常规的庆大霉素发酵液，一般为绛红小单胞菌(Micromonosporapurprua)KD1989经发酵后所得的发酵液；优选地，所述庆大霉素发酵液中，庆大霉素C1a占比高于30％，百分比是指庆大霉素C1a的质量在庆大霉素发酵液主要有效成分质量之和中的占比；更优选地，所述庆大霉素发酵液中，庆大霉素C1占23-35％(例如31％)、庆大霉素C1a占30-55％(例如35％)、庆大霉素C2和庆大霉素C2a质量之和占30-50％(例如34％)，百分比是指各组分的质量在庆大霉素发酵液主要有效成分质量之和中的占比，例如按照专利201710791469.5实施例1公开的方法制备所得的庆大霉素发酵液。本领域技术人员知晓，所述庆大霉素发酵液中的主要有效成分是指庆大霉素C1、庆大霉素C1a、庆大霉素C2和庆大霉素C2a。本领域技术人员知晓，步骤(1)中，所述庆大霉素发酵液一般需经预处理再进行层析。所述预处理可为本领域常规的预处理，例如将所述庆大霉素发酵液的pH调节至2后过滤。所述pH调节剂可为浓硫酸。所述过滤优选为添加过滤剂后经板框过滤或经陶瓷膜过滤。所述过滤剂可为本领域常规的过滤剂，例如硅藻土和/或珍珠岩。在预处理之后，例如，步骤(1)中，可以将pH为2左右的庆大霉素发酵液调整为pH至10.0-12.0或者6.0-8.0，然后上样、并层析；这里的pH调节物质可以为常规的调碱性的pH调节剂，如，氨水或氢氧化钾。本领域技术人员均知，在层析前应经上样步骤。上样量一般不应超过大孔吸附树脂、大孔弱酸性阳离子树脂或反相吸附树脂的最大载样量。当上样于大孔吸附树脂时，每100ml树脂，上样量一般为3-5g。当上样于大孔弱酸性阳离子树脂时，每100ml树脂，上样量一般为8-10g。当上样于反相吸附树脂时，每100ml树脂，上样量一般为6-8g。其中，所述上样的流速可为本领域常规的流速，优选为0.5-2BV/h，例如0.5BV/h、1BV/h或2BV/h。步骤(1)中，优选地，将pH调整为11.0-12.0的庆大霉素发酵液经大孔吸附树脂层析，例如pH调整为11的庆大霉素发酵液或pH调整为12的庆大霉素发酵液。步骤(1)中，优选地，将pH调整为11.0-12.0的层析液B1经大孔吸附树脂层析，例如pH调整为11的层析液B1或pH调整为12的层析液B1。步骤(1)中，所述大孔吸附树脂的种类可为本领域常规的可吸附庆大霉素C1a的大孔吸附树脂，一般为中等极性或弱极性大孔吸附树脂，优选为DM11树脂、LX1500树脂、HZ-816树脂、HZ-803树脂、HZ-814树脂和HZ-804树脂中的一种或多种，更优选为DM11树脂、LX1500树脂、HZ-816树脂、HZ-803树脂或HZ-804树脂。本领域技术人员均知，步骤(1)中，所述大孔吸附树脂层析的方式一般为柱层析，其中，柱体积可为2.7-3L，例如2.7L或3L；高径比可为3：1。本专利技术中，所述酸水溶液可为本领域常规的含有可溶于水的酸的水溶液，所述可溶于水的酸优选为硫酸、乙酸、磷酸和盐酸中的一种或多种。步骤(1)中，在所述pH调整为10.0-12.0的庆大霉素发酵液或所述pH调整为10.0-12.0的层析液B1经大孔吸附树脂层析前，还可按本领域常规操作进行除杂。其中，所述除杂的洗脱液可为水和/或pH2-5的酸水溶液。当所述除杂的洗脱液为水时，所述水的洗脱体积优选为3-5BV，例如3BV、4BV或5BV。当所述除杂的洗脱液为水时，所述水的洗脱流速优选为0.2-1BV/h，例如0.5BV/h或1BV/h。当所述除杂的洗脱液为pH2.0-5.0的酸水溶液时，所述pH2.0-5.0的酸水溶液的洗脱流速优选为0.5-1BV/本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种庆大霉素C1a的纯化方法，其特征在于，其包括下述步骤：/n(1)将pH调整为10.0-12.0的庆大霉素发酵液经大孔吸附树脂层析，得层析液A1；将pH调整为6.0-8.0的层析液A1经大孔弱酸性阳离子树脂层析，得层析液A2；所述大孔吸附树脂层析的流动相为pH 1.0-2.0的酸水溶液，所述大孔弱酸性阳离子树脂层析的流动相为pH11.0-12.0的氨水溶液；/n或者，将pH调整为6.0-8.0的庆大霉素发酵液经大孔弱酸性阳离子树脂层析，得层析液B1；将pH调整为10.0-12.0的层析液B1经大孔吸附树脂层析，得层析液B2；所述大孔弱酸性阳离子树脂层析的流动相为pH 11.0-12.0的氨水溶液，所述大孔吸附树脂层析的流动相为pH 1.0-2.0的酸水溶液；/n(2)将步骤(1)中所述层析液A2或所述层析液B2的pH调至10.0-12.0，经反相吸附树脂层析，得层析液C，将所述层析液C的pH调至4.0-8.0，即可；所述反相吸附树脂层析的流动相为pH 1.0-2.0的酸水溶液，所述反相吸附树脂为聚苯乙烯二乙烯基苯系树脂。/n

【技术特征摘要】
1.一种庆大霉素C1a的纯化方法，其特征在于，其包括下述步骤：
(1)将pH调整为10.0-12.0的庆大霉素发酵液经大孔吸附树脂层析，得层析液A1；将pH调整为6.0-8.0的层析液A1经大孔弱酸性阳离子树脂层析，得层析液A2；所述大孔吸附树脂层析的流动相为pH1.0-2.0的酸水溶液，所述大孔弱酸性阳离子树脂层析的流动相为pH11.0-12.0的氨水溶液；
或者，将pH调整为6.0-8.0的庆大霉素发酵液经大孔弱酸性阳离子树脂层析，得层析液B1；将pH调整为10.0-12.0的层析液B1经大孔吸附树脂层析，得层析液B2；所述大孔弱酸性阳离子树脂层析的流动相为pH11.0-12.0的氨水溶液，所述大孔吸附树脂层析的流动相为pH1.0-2.0的酸水溶液；
(2)将步骤(1)中所述层析液A2或所述层析液B2的pH调至10.0-12.0，经反相吸附树脂层析，得层析液C，将所述层析液C的pH调至4.0-8.0，即可；所述反相吸附树脂层析的流动相为pH1.0-2.0的酸水溶液，所述反相吸附树脂为聚苯乙烯二乙烯基苯系树脂。


2.如权利要求1所述的庆大霉素C1a的纯化方法，其特征在于，
步骤(1)中，所述大孔吸附树脂的种类为DM11树脂、LX1500树脂、HZ-816树脂、HZ-803树脂、HZ-814树脂和HZ-804树脂中的一种或多种，优选为DM11树脂、LX1500树脂、HZ-816树脂、HZ-803树脂或HZ-804树脂；
和/或，步骤(1)中，所述大孔吸附树脂层析的方式为柱层析，其中，柱体积优选为2.7-3L，高径比优选为3：1；
和/或，步骤(1)中，在所述pH调整为10.0-12.0的庆大霉素发酵液或所述pH调整为10.0-12.0的层析液B1经大孔吸附树脂层析前，经水和/或pH2-5的酸水溶液洗脱除杂；所述水的洗脱体积优选为3-5BV；所述水的洗脱流速优选为0.2-1BV/h；所述pH2.0-5.0的酸水溶液的洗脱流速优选为0.5-1BV/h；所述pH2.0-5.0的酸水溶液的pH优选为2.5、3.0或4.0；所述pH2.0-5.0的酸水溶液的酸优选为硫酸和/或乙酸；所述pH3.0-5.0的酸水溶液优选为pH2.5的硫酸溶液、pH3.0的硫酸溶液、pH4.0的硫酸溶液、pH2.5的乙酸溶液或pH3.0的乙酸溶液。


3.如权利要求1所述的庆大霉素C1a的纯化方法，其特征在于，步骤(1)中，将pH调整为11.0-12.0的庆大霉素发酵液经大孔吸附树脂层析，优选为pH调整为11的庆大霉素发酵液或pH调整为12的庆大霉素发酵液；
和/或，步骤(1)中，将pH调整为11.0-12.0的层析液B1经大孔吸附树脂层析，优选为pH调整为11的层析液B1或pH调整为12的层析液B1；
和/或，步骤(1)中，所述pH1.0-2.0酸水溶液的pH为1.0、1.5或2.0；
和/或，步骤(1)中，所述pH1.0-2.0酸水溶液的酸为硫酸和/或乙酸；优选地，所述pH1.0-2.0酸水溶液为pH1.0的硫酸水溶液、pH1.5的硫酸水溶液、pH2.0的硫酸水溶液、pH1.0的乙酸水溶液或pH1.5的乙酸水溶液；
和/或，步骤(1)中，所述pH1-2的酸水溶液的流速为0.5-1BV/h；
和/或，步骤(1)中，将pH调整为7.0-8.0的庆大霉素发酵液经大孔弱酸性阳离子树脂层析；
和/或，步骤(1)中，将pH调整为7.0-8.0的层析液A1经大孔弱酸性阳离子树脂层析；
和/或，步骤(1)中，所述pH11.0-12.0的氨水溶液为pH11.0的氨水溶液或pH12.0的氨水溶液；
和/或，步骤(1)中，所述pH11.0-12.0的氨水溶液的流速为0.5-1BV/h。


4.如权利要求1所述的庆大霉素C1a的纯化方法，其特征在于，步骤(1)中，所述大孔弱酸性阳离子树脂的种类为丙烯酸系大孔弱酸性树脂，优选为HZ-0156树脂、HZD-2树脂、D-152树脂、HD-2树脂和ZGD-115树脂中的一种或多种；
和/或，所述大孔弱酸性阳离子树脂层析的方式为柱层析，其中，柱体积优选为1L，高径比优选为(5:1)-(8:1)；
和/或，步骤(1)中，在所述pH调整为6.0-8.0的庆大霉素发酵液或所述pH调整为6.0-8.0的层析液A...

【专利技术属性】
技术研发人员：李继安，陈代杰，王铁柱，李亚军，林惠敏，邓旭，张会敏，
申请(专利权)人：河南仁华生物科技有限公司，上海医药工业研究院，
类型：发明
国别省市：河南;41