用于化妆品原料的优化的成纤维细胞提取物的制备方法技术

本发明专利技术属于生物技术领域，尤其为一种用于化妆品原料的优化的成纤维细胞提取物的制备方法，包括以下步骤：S1：收集真皮组织来源不同培养代数的成纤维细胞，且成纤维细胞的培养时间为20‑45天；S2：经体外定向诱导扩增为工作细胞株；S3：在体外经植物提取物及人间充质干细胞活性分泌物刺激处理后，强化分泌皮肤损伤修复因子。本发明专利技术定向调控后的人成纤维细胞分泌物同时具备人成纤维细胞及间充质干细胞双重活性分泌物；该混合物中富含皮肤组织修复与再生功能等多重细胞因子，并具备胶原蛋白富集、活性氧自由基清除组分强化炎性因子减弱等特征可以作为化妆品原料进行皮肤衰老性修复领域的应用。

Preparation method of fibroblast extract for cosmetic raw material optimization

【技术实现步骤摘要】
用于化妆品原料的优化的成纤维细胞提取物的制备方法
本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种用于化妆品原料的优化的成纤维细胞提取物的制备方法。
技术介绍
成纤维细胞与创伤修复：成纤维细胞(fibroblast)是疏松结缔组织的主要成分，由胚胎时期的间充质细胞(mesenchymalcell)分化而来，在修复由于细胞变性、坏死导致的组织缺损方面起重要作用。人皮肤成纤维细胞(humanskinfibroblast，人成纤维细胞)是皮肤组织重要结构成分，可合成和分泌胶原纤维、弹性纤维、网状纤维、透明质酸等细胞外基质，具有维持皮肤结构稳定、保持强度和弹性、修复损伤等功能。日常物理及化学性创伤造成皮肤组织细胞变性、坏死和组织缺损。在修复过程中，真皮乳头层成纤维细胞在受损部位增殖，合成分泌胶原纤维和基质成分，与新生毛细血管等共同形成肉芽组织，填补伤口组织缺损，有助于表皮细胞的覆盖完成修复。在这一过程中，真皮组织中成熟期静止状态的纤维细胞，以及具有分化潜能的少数间充质细胞在特定因素刺激下，可重新转变为成纤维细胞，共同参与组织损伤后的修复。成纤维细胞在皮肤组织修复与再生中的双重作用：成纤维在皮肤衰老与再生中起双重作用，适度激活是皮肤细胞再生修复的刺激信号，其中炎性细胞因子TGF-β1、IL-6，TNF-α是其中的关键性物质；当损伤创面较大或存在异常的炎症反应时，成纤维细胞过度活动其不受控制，造成创面过度收缩导致增生性瘢痕，过度表达的炎症性因子是导致成纤维细胞过度活化的重要原因。间充质干细胞调控成纤维细胞在皮肤组织修复中的相互作用：间充质干细胞(间充质干细胞，mesenchymalstemcells,)是一种体内的种子修复细胞。一方面，间充质干细胞的在体内可增殖分化成为成纤维细胞，直接代替与修复衰老死亡的皮肤细胞；另外一方面，间充质干细胞分泌途径分泌皮肤损伤修复生物活性分子调控成纤维细胞，包括纤连蛋白(Fibronectin)作为促进伤口愈合、血管内皮细胞生长因子(VEGF)促进皮肤再生、纤维芽细胞生长因子(bFGF)促进衰老组织的恢复、上皮细胞生长因子(EGF)促进内皮细胞增殖移动；肝细胞生长因子(HGF)激活细胞，治疗伤口效果；转化生长因子(TGF-β1)复原受损的组织并调节成纤维细胞增殖。在间充质干细胞与人成纤维细胞的相互作用中，间充质干细胞抑制TGF-β1所诱导的成纤维细胞向肌成纤维细胞分化，从而改善损伤愈合失调导致的疤痕疙瘩及组织纤维化。植物提取物调控成纤维细胞在皮肤组织修复中的相互作用：植物提取物用于皮肤损伤性修复已经相对成熟。例如杜仲提取物松脂醇二葡萄糖苷(PinoresinolDiglucoside，PDG)能显著刺激人成纤维细胞的增殖，促进胶原蛋白的分泌；芦荟来源的乙酰甘露多糖(Acemannan)促进人成纤维细胞增殖促进TGF-α，TGF-β1，EGF，IL-1β，IL-6，IL-8及TNF的分泌，Acemannan进一步调控I型胶原蛋白与III型胶原蛋白的比例，使得组织修复向更为优化的方向进行；水飞蓟素(Silymarin)对体外培养的瘢痕疙瘩成纤维细胞的增殖具有明显的抑制作用。工业化细胞培养提取物及在组织修复间的运用：目前在美容抗衰领域中，使用活化的间充质干细胞或人成纤维细胞进行中胚层导入进行损伤组织。更多关注在GMP环境下的细胞生产制备，将细胞培养的含有的上清物及提取物当作生物垃圾废弃，这极大地浪费了细胞在培养过程中分泌的皮肤损伤修复生物活性物质；另外一方面，在化妆品领域植物提取物多作为活性组分直接进行添加。人成纤维细胞及间充质干细胞具有分布广泛、取材方便、对机体损伤较小、体外培养容易成活等特点。在体外分别分离培养人成纤维细胞及间充质干细胞。在人成纤维细胞的培养过程中添加间充质干细胞分泌物及植物提取物对其分泌因子进行定向调控，有可能获得的分泌物具有特殊分泌谱的活性组分，为此，提出用于化妆品原料的优化的成纤维细胞提取物的制备方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，而提出的用于化妆品原料的优化的成纤维细胞提取物的制备方法。为了实现上述目的，本专利技术采用了如下技术方案：用于化妆品原料的优化的成纤维细胞提取物的制备方法，包括以下步骤：S1：收集真皮组织来源不同培养代数的成纤维细胞，且成纤维细胞的培养时间为20-45天；S2：经体外定向诱导扩增为工作细胞株；S3：在体外经植物提取物及人间充质干细胞活性分泌物刺激处理后，强化分泌皮肤损伤修复因子；S4：分离提取活性上清组分，形成高浓度无菌级别提取物原料。优选的，所述成纤维细胞的种子细胞株为1-3代，工作细胞株为4-15代，间充质干细胞为不同组织来源的细胞包括但不限于血液、新生儿伴随组织、成体脂肪和成体皮肤，所述新生儿伴随组织包括脐血、脐带、羊膜和胎盘，经体外诱导扩增为间充质干细胞，收集培养上清以3KD超滤截留相关因子，间充质干细胞为新生儿伴随组织及成体脂肪、成体皮肤来源的诱导一定代数的细胞，且间充质干细胞为4-10代。优选的，所述间充质干细胞培养体系为生理盐水加10％浓度的人血小板裂解液的无血清添加物，优选的，收集的培养上清以3KD3500rpm15min超滤离心后，收集上层超滤物质洗涤后做为浓缩因子。优选的，所述S3中，利用人间充质干细胞活性提取物，在工作细胞培养的全过程中调控人皮肤成纤维细胞的增殖，促进皮肤损伤修复因子蛋白的分泌，添加比例为间充质分泌物：成纤维培养基＝2:15。优选的，利用2x10-3μmol/L浓度的杜仲提取物松脂醇二葡萄糖苷在培养初期刺激人皮肤成纤维细胞的增殖，促进胶原蛋白的分泌。优选的，利用100μg/ml浓度得芦荟来源的乙酰甘露多糖(Acemannan)在培养中期刺激人皮肤成纤维细胞的增殖，促进胶原蛋白的分泌，并进一步优化调控I型胶原蛋白与III型胶原蛋白的比例。优选的，其特征在于：利用200μmol/ml浓度的水飞蓟素(Silymarin)在培养中后期抑制期刺激人皮肤成纤维细胞的进一步增殖，避免过度活化。优选的，其特征在于：成纤维细胞培养上清3KD3500rpm15min超滤离心后，收集上层超滤物质洗涤后做为浓缩因子。优选的，收集超滤后的因子，洗涤次数为两次，提取物终浓度为4mg/ml，0.22μm除菌过滤保存。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：1.本专利技术提供的人成纤维细胞提取物富含多种生长因子、蛋白酶、小分子多肽的浓缩物，与皮肤损伤修复与再生中所必须的因子一致；2.本专利技术利用植物提取物优化调控人成纤维细胞的蛋白分泌谱，富集皮肤损伤修复因子，降低内源性皮肤损伤因子组分；3.本专利技术使用3-10代之间的人成纤维细胞培养上清分泌物，最大限度去除了衰老人成纤维细胞代谢产物有可能引发的内源性皮肤损伤因子；4.本专利技术利用间充质干细胞修复皮肤损伤，及其成纤维细胞增殖调控双重生物学特性，提取其体外培养、增殖过程中分泌的具备皮肤损伤的复合活性物质；5.本专利技术不仅降本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于化妆品原料的优化的成纤维细胞提取物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：/nS1：收集真皮组织来源不同培养代数的成纤维细胞，且成纤维细胞的培养时间为20-45天；/nS2：经体外定向诱导扩增为工作细胞株；/nS3：在体外经植物提取物及人间充质干细胞活性分泌物刺激处理后，强化分泌皮肤损伤修复因子；/nS4：分离提取活性上清组分，形成高浓度无菌级别提取物原料。/n

【技术特征摘要】
1.用于化妆品原料的优化的成纤维细胞提取物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：收集真皮组织来源不同培养代数的成纤维细胞，且成纤维细胞的培养时间为20-45天；
S2：经体外定向诱导扩增为工作细胞株；
S3：在体外经植物提取物及人间充质干细胞活性分泌物刺激处理后，强化分泌皮肤损伤修复因子；
S4：分离提取活性上清组分，形成高浓度无菌级别提取物原料。


2.根据权利要求1所述的用于化妆品原料的优化的成纤维细胞提取物的制备方法，其特征在于：所述成纤维细胞的种子细胞株为1-3代，工作细胞株为4-15代，间充质干细胞为不同组织来源的细胞包括但不限于血液、新生儿伴随组织、成体脂肪和成体皮肤，所述新生儿伴随组织包括脐血、脐带、羊膜和胎盘，经体外诱导扩增为间充质干细胞，收集培养上清以3KD超滤截留相关因子，间充质干细胞为新生儿伴随组织及成体脂肪、成体皮肤来源的诱导一定代数的细胞，且间充质干细胞为4-10代。


3.根据权利要求2所述的用于化妆品原料的优化的成纤维细胞提取物的制备方法，其特征在于：所述间充质干细胞培养体系为生理盐水加10％浓度的人血小板裂解液的无血清添加物。


4.根据权利要求2所述的用于化妆品原料的优化的成纤维细胞提取物的制备方法，其特征在于：收集的培养上清以3KD3500rpm15min超滤离心后，收集上层超滤物质洗涤后做为浓缩因子。


5.根据权利要求1所述的用于化妆品原料的优化的成纤维细胞提取物的制备方法，...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵晋岗，
申请(专利权)人：诺恩诺德医学研究院北京有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11