一种负载生长因子的复合缓释微粒及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种负载生长因子的复合缓释微粒的制备方法，包括以下步骤：由胶原蛋白和壳聚糖组成胶原蛋白‑壳聚糖支架，由壳聚糖和弹性蛋白重组体组成包裹生长因子的微型胶囊，将所述微型胶囊嵌合在所述胶原蛋白‑壳聚糖支架上制备得到产品。本发明专利技术提供一种负载生长因子的复合缓释微粒的制备方法，首先制备得到具有三维折叠结构的胶原蛋白‑壳聚糖支架，该支架的孔隙中嵌合包裹生长因子的多层微型胶囊，对其中包裹的生长因子具有长时匀速的缓释作用，从而实现生长因子主动诱导缺损处组织修复。本发明专利技术还提供了一种负载生长因子的复合缓释微粒，具有良好的生物相容性、生物降解性和极低的免疫原性，使生长因子具有长时间，均匀的释放。

【技术实现步骤摘要】
一种负载生长因子的复合缓释微粒及其制备方法
本专利技术涉及一种复合缓释微粒，尤其涉及一种负载生长因子的复合缓释微粒及其制备方法。
技术介绍
目前，富血小板血浆(Platelet-richplasma，简称PRP)，是自体全血经离心后得到的血小板浓缩物，PRP中含有大量生长因子及蛋白质，广泛应用于临床：骨关节的修复、大面积烧伤皮肤的修复以及医美整形等领域中。胶原蛋白是细胞外基质(ECM)的主要成份，属于结构蛋白质，约占哺乳动物蛋白质总质量的1/3，大量存在于皮肤、韧带、软骨、肌键等结缔组织或器官中。胶原具有良好的生物相容性，植入体内无毒副作用和刺激性，不易引起机体免疫反应，而且也有利于细胞的黏附、增殖和分化，加快创面愈合，并可降解而为新生组织提供足够的空间，广泛应用于生物材料的研究和开发利用中。但是单一材料存在着生物活性、强度等问题。壳聚糖是一种天然碱性聚合电解质多糖，具有良好的生物相容性和抗菌活性，并且价格低廉。壳聚糖表面带有正电荷，能够吸附带负电的红细胞而诱导其聚集，进一步促进血小板凝血，因此被广泛应用于伤口止血和抗菌领域。现有的负载生长因子的胶原蛋白-壳聚糖微粒作用于人体，被激活后1小时内达到90％的释放，在体外作用3天左右，在体内5天左右凋亡，作用时效短且集中，不利于持续调动和补充生长因子对创面进行修复。
技术实现思路
为了克服现有技术的不足，本专利技术的目的之一在于提供一种负载生长因子的复合缓释微粒的制备方法，制备工艺条件温和，原料易得。本专利技术的目的之二在于提供一种负载生长因子的复合缓释微粒，具有良好的生物相容性、生物降解性和极低的免疫原性，对其中包裹的生长因子具有长时匀速的缓释作用，从而实现生长因子主动诱导缺损处组织修复。本专利技术的目的之一采用如下技术方案实现：一种负载生长因子的复合缓释微粒的制备方法，包括以下步骤：由胶原蛋白和壳聚糖组成胶原蛋白-壳聚糖支架，由壳聚糖和弹性蛋白重组体组成包裹生长因子的微型胶囊，将所述微型胶囊嵌合在所述胶原蛋白-壳聚糖支架上制备得到产品。进一步地，所述微型胶囊的制备过程如下：(1)制备弹性蛋白重组体和壳聚糖的混合溶液：取弹性蛋白重组体和中分子量壳聚糖按1：1的比例进行混合，中分子量壳聚糖的分子量为300-400KDa，脱乙酰度75-85％，用氯化钠溶液溶解；(2)制备包裹生长因子的碳酸钙微粒：在生长因子溶液中先加入碳酸钠溶液，再加入标记生长因子的荧光素，最后加入氯化钙溶液，搅拌后沉淀一段时间，去除上清液，洗涤后得到包裹生长因子的碳酸钙微粒；(3)将上述步骤(2)的包裹生长因子的碳酸钙微粒浸入到上述步骤(1)的混合溶液中，重复进行浸泡、洗涤过程，采用悬浮沉淀法去除上清液，得到由弹性蛋白重组体和壳聚糖包裹生长因子的微型胶囊。进一步地，所述胶原蛋白-壳聚糖支架的制备过程如下：将胶原蛋白和低分子量壳聚糖分别配置成溶液，混合后搅拌至溶液不透明，超声去除气泡，将混合溶液冷冻后冻干，将冻干后的固体放入交联剂中浸泡交联，洗去交联剂，冷冻后冻干，即得胶原蛋白-壳聚糖支架。进一步地，将胶原蛋白-壳聚糖支架溶解后，加入由弹性蛋白重组体和壳聚糖包裹生长因子的微型胶囊进行浸泡，冻干，即得产品。进一步地，所述弹性蛋白重组体的制备过程如下：采用基因重组技术制备重组大肠杆菌BLR(DE3)表达弹性蛋白重组体，其中诱导温度为25℃，pH为7.0，溶氧为30％；以5g·5L-1·5h-1流速流加葡萄糖，收获培养物，通过超声破碎进行裂解，离心除去不溶性残渣，并将澄清的裂解物进行冷热循环离心，然后冷冻干燥，即得弹性蛋白重组体。弹性蛋白重组体(ELR)是经过基因工程改造的多肽，可模仿天然弹性蛋白并表现出对温度敏感性，本专利技术使用ELR的一级结构为通过包含L-精氨酸-甘氨酸-L-天冬氨酸(RGD)残基来表现出生物活性，同时利用负天门冬氨酸部分实现与壳聚糖的自组装。进一步地，将胶原蛋白和壳聚糖分别溶解在3％的乙酸水溶液中，形成质量浓度分别为2-5％的胶原蛋白溶液和2-5％的壳聚糖溶液，混合时，胶原蛋白溶液和壳聚糖溶液的体积比为1:2-5。进一步地，所述低分子量壳聚糖的分子量为100-200KDa，脱乙酰度为80-90％。进一步地，所述生长因子为转化生长因子-β和血小板衍生生长因子-AB中的至少一种。进一步地，所述胶原蛋白-壳聚糖支架的平均孔径为140-160um，包裹生长因子的壳聚糖-弹性蛋白重组体微型胶囊的平均直径为7-10um。进一步地，在构建碳酸钙微粒的过程中、将包裹生长因子的碳酸钙微粒浸泡在壳聚糖弹性蛋白重组体制备微型胶囊的过程中、包裹生长因子的微型胶囊嵌合到胶原蛋白-壳聚糖支架的过程中，把每一步骤中的上清液收集起来进行荧光检测，以确定在构建和嵌合过程中生长因子蛋白的损失情况。本专利技术的目的之二采用如下技术方案实现：一种负载生长因子的复合缓释微粒，由上述方法制备得到。相比现有技术，本专利技术的有益效果在于：本专利技术提供一种负载生长因子的复合缓释微粒的制备方法，首先制备得到具有三维折叠结构的胶原蛋白-壳聚糖支架，该支架的孔隙中嵌合包裹生长因子的多层微型胶囊，对其中包裹的生长因子具有长时匀速的缓释作用，从而实现生长因子主动诱导缺损处组织修复。将生长因子包裹在微型胶囊中，由于微型胶囊的直径更小，作用面积更大，相较于平面的凝剂对创面的作用效果更好，将制备的微型胶囊嵌合在胶原蛋白-壳聚糖支架上，一方面，微型胶囊的多层结构可以降低聚合物的流动性；另一方面，采用的弹性蛋白重组体对人体温度敏感，可以使生长因子的释放更加缓慢。本专利技术还提供了一种负载生长因子的复合缓释微粒，具有良好的生物相容性、生物降解性和极低的免疫原性，使生长因子具有长时间，均匀的释放。附图说明图1为本专利技术实施例1中的胶原蛋白-壳聚糖的扫描电镜图；图2为本专利技术实施例1中的胶原蛋白-壳聚糖横截面的扫描电镜图；图3为本专利技术实施例1中包裹生长因子的壳聚糖-弹性蛋白重组体微型胶囊的扫描电镜图；图4为本专利技术实施例1中微型胶囊在胶原蛋白-壳聚糖支架的孔隙中排列方式，以及形态嵌合的结构示意图；图5为本专利技术实施例1的产品在25℃和37℃的PBS中的释放曲线。具体实施方式下面，结合附图以及具体实施方式，对本专利技术做进一步描述，需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。实施例1一种负载生长因子的复合缓释微粒的制备方法，包括以下步骤：(1)制备胶原蛋白-壳聚糖支架：将胶原蛋白和分子量为100KDa，脱乙酰度为80％的壳聚糖分别溶解在3％的乙酸水溶液中，配置成质量浓度为2％的胶原蛋白溶液和2％的壳聚糖溶液，将胶原蛋白溶液搅拌过夜，壳聚糖溶液搅拌30min，以胶原蛋白溶液和壳聚糖溶液的体积比为1:2混合，搅拌至溶液不透明，超声去除气泡，将混合溶液倒入分离的培养皿中，在-40℃，冷冻24h，然本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种负载生长因子的复合缓释微粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：由胶原蛋白和壳聚糖组成胶原蛋白-壳聚糖支架，由壳聚糖和弹性蛋白重组体组成包裹生长因子的微型胶囊，将所述微型胶囊嵌合在所述胶原蛋白-壳聚糖支架上制备得到产品。/n

【技术特征摘要】
1.一种负载生长因子的复合缓释微粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：由胶原蛋白和壳聚糖组成胶原蛋白-壳聚糖支架，由壳聚糖和弹性蛋白重组体组成包裹生长因子的微型胶囊，将所述微型胶囊嵌合在所述胶原蛋白-壳聚糖支架上制备得到产品。


2.根据权利要求1所述一种负载生长因子的复合缓释微粒的制备方法，其特征在于，所述微型胶囊的制备过程如下：
(1)制备弹性蛋白重组体和壳聚糖的混合溶液：取弹性蛋白重组体和中分子量壳聚糖按1：1的比例进行混合，中分子量壳聚糖的分子量为300-400KDa，脱乙酰度75-85％，用氯化钠溶液溶解；
(2)制备包裹生长因子的碳酸钙微粒：在生长因子溶液中先加入碳酸钠溶液，再加入标记生长因子的荧光素，最后加入氯化钙溶液，搅拌后沉淀一段时间，去除上清液，洗涤后得到包裹生长因子的碳酸钙微粒；
(3)将上述步骤(2)的包裹生长因子的碳酸钙微粒浸入到上述步骤(1)的混合溶液中，重复进行浸泡、洗涤过程，采用悬浮沉淀法去除上清液，得到由弹性蛋白重组体和壳聚糖包裹生长因子的微型胶囊。


3.根据权利要求2所述一种负载生长因子的复合缓释微粒的制备方法，其特征在于，所述胶原蛋白-壳聚糖支架的制备过程如下：将胶原蛋白和低分子量壳聚糖分别配置成溶液，混合后搅拌至溶液不透明，超声去除气泡，将混合溶液冷冻后冻干，将冻干后的固体放入交联剂中浸泡交联，洗去交联剂，冷冻后冻干，即得胶原蛋白-壳聚糖支架。


4.根据权利要求3所述一种负载生长因子的复合缓释微粒的制备方法，其特征在于，将胶原蛋白-壳聚糖支架溶解后，加入由弹性蛋白重组体和壳...

【专利技术属性】
技术研发人员：石锐，周新钦，曹晶晶，张明，杨帅，张建鑫，王川，
申请(专利权)人：河南汇博医疗股份有限公司，
类型：发明
国别省市：河南;41