具有强抗氧化及金黄色葡萄球菌抑制活性的石榴皮有效组分的制备方法技术

本发明专利技术涉及一种具有强抗氧化及金黄色葡萄球菌抑制活性的石榴皮有效组分的制备方法，该方法以石榴皮提取物的大孔树脂纯化物为原料，利用非线性反相色谱技术，纯化得到得到安石榴苷含量高达60.6%的石榴皮有效组分，通过考察分析柱在不同上样量下所得石榴皮有效组分中安石榴苷的含量、回收率及制备效率，从而得到了具有强抗氧化及金黄色葡萄球菌抑制活性的石榴皮有效组分。该方法工艺稳定，非常适合进一步的工业化生产。为基于石榴皮有效组分为原料药的新药研发打下坚实基础。

【技术实现步骤摘要】
具有强抗氧化及金黄色葡萄球菌抑制活性的石榴皮有效组分的制备方法
本专利技术涉及一种具有强抗氧化及金黄色葡萄球菌抑制活性的石榴皮有效组分的制备方法。
技术介绍
石榴，又称安石榴，是一种在我国尤其是新疆地区(古称“西域”)有着广泛种植的水果。皮酸、涩、温，具有涩肠止泻，止血，驱虫等功能。现代研究表明，石榴皮中含有丰富的鞣质类化合物，具有广泛的生物活性。而其中又以安石榴苷和鞣花酸为代表。特别是安石榴苷，其在石榴皮药材中的含量约为6％，远高于石榴皮鞣素、没食子酸和鞣花酸。安石榴苷具有典型的多酚的抗氧化活性，此外还有广泛的抗菌、抗病毒、抗肿瘤等活性。基于石榴皮提取物为原料，纯化得到具有抗氧化抗菌活性较好的有效组分，对于石榴皮的新药研发具有十分重要的意义。由于安石榴苷属于鞣质，具有鞣质的特殊性质，即在正相硅胶、凝胶、聚酰胺等填料上的不可逆吸附较强，因此能用来富集纯化的填料种类较少，主要集中在适合富集多酚的大孔树脂和反相硅胶上。目前主流的石榴皮提取物工艺采用适用多酚富集的大孔树脂(如HPD系列)来处理石榴皮提取物，用水洗去其中的多糖和植物蛋白，再用高浓度的乙醇进行洗脱，所得部位浓缩干燥，是为石榴皮提取物的大孔树脂纯化物。已报道的文献指出石榴皮提取物的大孔树脂纯化物中安石榴苷含量通常可达15％至35％之间，安石榴苷回收率达到在90％以上，且可达到产业化水准，即工艺稳定地提供富含安石榴苷的有效组分。亦有报道文献将大孔树脂纯化法和其他方法联合起来使用，将MCI树脂柱层析甚至逆流等技术联合起来，即用另外一种方法如使用MCI柱层析或者逆流色谱的方法继续富集纯化石榴皮提取物的大孔树脂纯化物，从而使安石榴苷在有效组分中的含量达到80％-90％。然而，上述方法的产量规模很小，级别往往是百毫克或克级，距离工业化生产的技术转化，存在很大的距离。因此，研发一种抗氧化和金黄色葡萄球菌抑制活性较好的、稳定可放大至工业化生产的安石榴苷含量较高的石榴皮有效组分的制备方法意义重大。如上所述，除大孔树脂外反相色谱填料较合适于纯化多酚类化合物。反相色谱主要利用疏水效应对不同极性的化合物进行选择性吸附分配，从而使化合物达到较好程度的分离。反相色谱的种类很多，通常是基于单分散的硅胶键合上不同碳原子数的疏水性烷基链，而其中最为通用且典型的即十八烷基链键合，即常用的C18。将填料填充于色谱柱管中装载成色谱柱使用，是目前主流的做法。而色谱法根据上样量再吸附等温线的线性或非线性部位区分可以分为线性色谱和非线性色谱，又称为过载色谱。线性色谱即上样量处于吸附等温线的线性区域，峰型为高斯对称分布，通常用于样品分析领域。而非线性色谱则是上样量处于吸附等温线的非线性领域，其峰型通常成不对称的三角形，通常可用于样品的纯化精制。非线性色谱由于上样量高，再加上近年来其理论研究逐渐成熟，慢慢在纯化领域占据了重要的地位。因此，基于非线性反相色谱对已产业化的石榴皮提取物的大孔树脂纯化物进而二次纯化精制，以生产并实现中试甚至生产级别的工艺开发，可使其中安石榴苷的含量达到高水准。通过分析型色谱优化非线性色谱的上样量、安石榴苷回收率、生产效率以及所得有效部位中安石榴苷的含量，得出最佳工艺，再放大到对应的中试色谱柱上，得到具有较强抗氧化、抗菌活性的高安石榴苷含量的石榴皮有效组分。整套工艺属于对石榴皮提取物大孔树脂纯化物的二次再开发，其中安石榴苷含量高于60.6％。所得石榴皮有效组分具有很强的抗氧化和金黄色葡萄球菌抑制活性，且中试放大工艺稳定，具有很高的产业化价值。
技术实现思路
本专利技术的目的在于，提供出一种具有强抗氧化及金黄色葡萄球菌抑制活性的石榴皮有效组分的制备方法，该方法以石榴皮提取物的大孔树脂纯化物为原料，利用非线性反相色谱技术，纯化得到得到安石榴苷含量高达60.6％的石榴皮有效组分，通过考察分析柱在不同上样量下所得石榴皮有效部位中安石榴苷的含量、回收率及制备效率，确认对于C18色谱柱，上样量范围限定在石榴皮大孔树脂纯化物的质量与填料质量的比例为250mg/g-1250mg/g之间时制备出的石榴皮组分的抗氧化活性和金黄色葡萄球菌抑制活性较高。当该比例为500mg/g时，所得石榴皮有效部位安石榴苷含量高于60.6％，水溶性较纯化前大幅提高，制备效率较高，安石榴苷回收率亦高达73.2％，其抗氧化活性和金黄色葡萄球菌抑制活性仍维持在很高的水平。该方法工艺稳定，非常适合进一步的工业化生产。为基于石榴皮有效组分为原料药的新药研发打下坚实基础。本专利技术所述的一种具有强抗氧化及金黄色葡萄球菌抑制活性的石榴皮有效组分的制备方法，按下列步骤进行：a、通过高效液相色谱仪，以甲醇或乙腈为有机相A相，0.1％甲酸水为水相B相，通过液相色谱的双泵调整A相和B相至流动相为甲醇-0.1％甲酸水混合物，其中甲醇含量范围在5％-45％之间，或流动相为乙腈-0.1％甲酸水混合物，其中乙腈含量在5％-30％之间，流速控制为2.4mL/min，柱温室温，平衡反相C18色谱柱，长度250mm，内径10mm，填充物粒径10μm，平衡至基线水平；b、分别称取500mg，750mg，1000mg，1500mg的石榴皮提取物大孔树脂纯化物，均溶于水中配制成浓度为500mg/mL的溶液，离心去除悬浮在其中的沉淀，至于温度4℃冰箱中放置15小时，将样品分别进样至步骤a中平衡好的色谱柱中，进样后即开始接取组分，将所得组分溶液按每分钟一个的速率接在容器里，转移至液相小瓶中待测，从0min-40min的区间里，共计接取40个组分；c、使用高效液相色谱仪，配以紫外检测器和分析型反相C18色谱柱，长度250mm，内径4.6mm，填充物粒径10μm，柱温室温，流速1.0mL/min，监测波长254nm，对步骤b所得各组分样品，进样体积5微升，记下各样品中安石榴苷的峰面积A及所有峰的总面积A0，以接下的各组分的序号数(x)为横坐标，对应各组分安石榴苷和前杂质的占比为纵坐标，在同一张图上做η(％)-x和α(％)-x图；d、对于步骤b中，上样量为500mg时所得的一系列组分，合并0min至40min之间的组分，于温度50℃浓缩至5mL，真空冷冻干燥得到组分1；或上样量为750mg所得的一系列组分，合并0min至40min之间的组分，于温度50℃浓缩至5mL，真空冷冻干燥得到组分2；或上样量为1000mg所得的一系列组分，合并0min至40min之间的组分，于温度50℃浓缩至5mL，真空冷冻干燥得到组分3；或上样量为1500mg所得的一系列组分，合并0min至40min之间的组分，于温度50℃浓缩至5mL，真空冷冻干燥得到组分4，即得到具有强抗氧化及金黄色葡萄球菌抑制活性的石榴皮有效组分。步骤a中使用的流动相为甲醇-0.1％甲酸水混合溶液，甲醇含量在10％-30％之间；或流动相为乙腈-0.1％甲酸水混合溶液，乙腈含量在6％-20％之间。步骤d中上样量为500mg时所得的一系列组分，合并11min至30min之间的组分；或上样量为750mg时所得的一系列组分，合并9min至26min之间的组分；或上样量为1000m本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种具有强抗氧化及金黄色葡萄球菌抑制活性的石榴皮有效组分的制备方法，其特征在于按下列步骤进行：/na、通过高效液相色谱仪，以甲醇或乙腈为有机相A相，0.1%甲酸水为水相B相，通过液相色谱的双泵调整A相和B相至流动相为甲醇-0.1%甲酸水混合物，其中甲醇含量范围在5%-45%之间，或流动相为乙腈-0.1%甲酸水混合物，其中乙腈含量在5%-30%之间，流速控制为2.4 mL/min，柱温室温，平衡反相C18色谱柱，长度250 mm，内径10 mm，填充物粒径10 μm，平衡至基线水平；/nb、分别称取500 mg，750 mg，1000 mg，1500 mg的石榴皮提取物大孔树脂纯化物，均溶于水中配制成浓度为500 mg/mL的溶液，离心去除悬浮在其中的沉淀，至于温度4℃冰箱中放置15小时，将样品分别进样至步骤a中平衡好的色谱柱中，进样后即开始接取组分，将所得组分溶液按每分钟一个的速率接在容器里，转移至液相小瓶中待测，从0 min-40 min的区间里，共计接取40个组分；/nc、使用高效液相色谱仪，配以紫外检测器和分析型反相C18色谱柱，长度250 mm，内径4.6 mm，填充物粒径10 μm，柱温室温，流速1.0 mL/min，监测波长254 nm，对步骤b所得各组分样品，进样体积5微升，记下各样品中安石榴苷的峰面积A及所有峰的总面积A...

【技术特征摘要】
1.一种具有强抗氧化及金黄色葡萄球菌抑制活性的石榴皮有效组分的制备方法，其特征在于按下列步骤进行：
a、通过高效液相色谱仪，以甲醇或乙腈为有机相A相，0.1%甲酸水为水相B相，通过液相色谱的双泵调整A相和B相至流动相为甲醇-0.1%甲酸水混合物，其中甲醇含量范围在5%-45%之间，或流动相为乙腈-0.1%甲酸水混合物，其中乙腈含量在5%-30%之间，流速控制为2.4mL/min，柱温室温，平衡反相C18色谱柱，长度250mm，内径10mm，填充物粒径10μm，平衡至基线水平；
b、分别称取500mg，750mg，1000mg，1500mg的石榴皮提取物大孔树脂纯化物，均溶于水中配制成浓度为500mg/mL的溶液，离心去除悬浮在其中的沉淀，至于温度4℃冰箱中放置15小时，将样品分别进样至步骤a中平衡好的色谱柱中，进样后即开始接取组分，将所得组分溶液按每分钟一个的速率接在容器里，转移至液相小瓶中待测，从0min-40min的区间里，共计接取40个组分；
c、使用高效液相色谱仪，配以紫外检测器和分析型反相C18色谱柱，长度250mm，内径4.6mm，填充物粒径10μm，柱温室温，流速1.0mL/min，监测波长254nm，对步骤b所得各组分样品，进样体积5微升，记下各样品中安石榴苷的峰面积A及所有峰的总面积A0，以接下的各组分的序号数（x）为横坐标，对应各组分安石榴苷和前杂质的占比为纵坐标，在同一张图上做η（%）-x和α（%）-x图；
d、将步骤b中上样量为500mg时所得的一系列组分，合并0min至40min之间的组分，于温度50℃浓缩至5mL，真空冷...

【专利技术属性】
技术研发人员：阿吉艾克拜尔·艾萨，孙光映，木尼热·阿布都艾尼，古丽契热·阿地力，赵永昕，
申请(专利权)人：中国科学院新疆理化技术研究所，
类型：发明
国别省市：新疆;65