CTLA-4 Aptamer靶向共负载PD-1 siRNA纳米颗粒及其制备和应用制造技术

本发明专利技术公开了一种CTLA‑4 Aptamer靶向共负载PD‑1 siRNA纳米颗粒及其制备和应用，该纳米颗粒包括纳米载体和负载于其上的活性成分，所述活性成分包括CTLA‑4 Aptamer和PD‑1 siRNA。本发明专利技术的纳米颗粒将CTLA‑4 Aptamer和PD‑1 siRNA共负载于纳米递送体系，通过纳米颗粒表层的CTLA‑4 Aptamer靶向介导，靶向CTLA‑4配体细胞，同时可与负载的PD‑1siRNA联合作用于同一免疫细胞，尤其是Treg细胞，促进协同免疫反应的产生；而且，该纳米颗粒与单独的CTLA‑4 Aptamer与PD‑1 siRNA的联合应用相比，能够大大提高CTLA‑4 Aptamer与PD‑1 siRNA的联合免疫治疗效果。

CTLA-4 aptamer targeted co loaded PD-1 siRNA nanoparticles and their preparation and Application

【技术实现步骤摘要】
CTLA-4Aptamer靶向共负载PD-1siRNA纳米颗粒及其制备和应用
本专利技术属于医药
，具体涉及一种CTLA-4Aptamer靶向共负载PD-1siRNA纳米颗粒及其制备和应用。
技术介绍
免疫检查点抑制剂推进了癌症免疫疗法的发展，在临床得到了广泛的应用，尤其是PD-1单抗和CTLA-4单抗，两者的联用也在黑色素瘤、肾细胞癌和非小细胞肺癌的临床试验中取得了显著疗效。PD-1/PD-L1途径通过抑制T细胞促进Tregs(调节性T细胞)的发育和功能行使，从而维持具有潜在致病性的自身反应性T细胞和Tregs之间的动态平衡。CTLA-4在T细胞上表达并且对T细胞活化具有抑制作用。它是CD28的同源物，和抗原递呈细胞(APCs)上的CD80、CD86结合并下调T细胞活化，增加Treg(调节性T细胞)活性。小干扰RNA(siRNA)是一段长为20-25个碱基对的双链RNA。利用siRNA干扰目的蛋白的表达已被用于研究治疗各种疾病，PD-1siRNA也被证实可发挥PD-1免疫检查点抑制剂的作用。核酸适配体(Aptamer，缩写为Apt)是一段长为10nt至100nt的具有一定空间结构的寡核苷酸，适配体具有类似于抗体的极高的亲和力和特异性，但与抗体相比，其制备过程更加简单，时间短，批次间差异小，免疫原性和毒性更小。CTLA-4Aptamer已被证实能够有效靶向表达CTLA-4的免疫细胞，与CTLA-4结合，刺激效应T细胞活化增殖，抑制肿瘤生长。目前的研究显示，PD-1单抗和CTLA-4单抗的双免疫阻断作用机制主要是两者分别作用于免疫调节的启动及效应阶段，能够发挥协同作用。将两者同时或先后给药产生协同作用的原因有两种解释，一种解释是这两种药物同时作用于一个细胞，引起级联反应放大抗肿瘤效应，另一种解释是两者趋向于靶向不同类型的免疫细胞，协同增强抗肿瘤免疫反应。但是目前尚未有将两种免疫检查点抑制剂共同负载在一个药物纳米载体上并研究其作用于同一个免疫细胞产生的抗肿瘤免疫效应的报道。
技术实现思路
针对现有技术中的缺陷，本专利技术的一个目的是提供一种CTLA-4Aptamer靶向共负载PD-1siRNA纳米颗粒。为了实现上述目的，本专利技术采用了如下的技术方案：一种CTLA-4Aptamer靶向共负载PD-1siRNA纳米颗粒，包括纳米载体和负载于其上的活性成分，所述活性成分包括CTLA-4Aptamer和PD-1siRNA。在本专利技术的一些实施方案中，所述CTLA-4Aptamer通过吸附或化学键连接分布于所述纳米载体的表层。在本专利技术的一些实施方案中，所述PD-1siRNA通过包载分布于所述纳米载体的内部和/或通过吸附分布于所述纳米载体的表层。在本专利技术的一些实施方案中，所述纳米载体由生物可吸收的聚合物与阳离子脂质(DOTAP)或其修饰物构成或由生物可吸收的聚合物、磷脂类化合物构成；所述磷脂类化合物为二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)或其修饰物、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)或其修饰物、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺(DPPE)或其修饰物、二肉豆蔻酰基磷脂酰乙醇胺(DMPE)或其修饰物、二月桂酰基磷脂酰乙醇胺(DLPE)或其修饰物中的一种或多种。在本专利技术的一些实施方案中，所述生物可吸收的聚合物为PLGA、PLGA-S-S-PEG、PLGA-PEG、PCL-PEG、PCL-S-S-PEG中的至少一种。本专利技术还提供了上述CTLA-4Aptamer靶向共负载PD-1siRNA纳米颗粒的制备方法，包括步骤：将生物可吸收的共聚物与DOTAP或其修饰物混合得到杂化薄膜，然后水化，超声得到杂化纳米粒混悬液，将PD-1siRNA和二级结构处理后的CTLA-4Aptamer混匀，加入所述杂化纳米粒混悬液，振荡，得到表层负载有PD-1siRNA和CTLA-4Aptamer的杂化纳米颗粒；或先使磷脂类化合物与CTLA-4Aptamer反应通过化学键连接，再与PD-1siRNA、生物可吸收的聚合物混合，制备纳米颗粒，得到表层负载CTLA-4Aptamer、内部负载PD-1siRNA的纳米颗粒。在本专利技术的一些实施方案中，对CTLA-4Aptamer进行二级结构处理的操作包括：将CTLA-4Aptamer溶于DEPC水，在90-100℃下加热5-10min，缓慢降至室温，得到二级结构处理后的CTLA-4Aptamer。在本专利技术的一些实施方案中，杂化纳米粒混悬液的具体操作为：将PLGA-S-S-PEG或PLGA-PEG与DOTAP用溶剂溶解并蒸发溶剂得到混合物薄膜，然后用DEPC水在60℃下水化处理30-60min，在冰浴条件下超声3-10min。在本专利技术的一些实施方案中，所述PLGA-S-S-PEG或PLGA-PEG与阳离子脂质(DOTAP)的质量比为2-10:1。在本专利技术的一些实施方案中，DOTAP或其修饰物与CTLA-4Aptamer的质量比为2-10:1。在本专利技术的一些实施方案中，N/P比为3:1以上。本专利技术还提供了内部负载PD-1siRNA表层负载CTLA-4Aptamer的PLGA-S-S-PEG纳米颗粒的制备方法。包括如下步骤：(1)将DSPE-PEG与CTLA-4Aptamer连接将DSPE-PEG5000-COOH溶于水，加入EDC和NHS，反应15min，羧基活化后加入氨基修饰的核酸适配体反应3-10h，水洗超滤，冻干，得到DSPE-PEG-aptamer；(2)制备负载siRNA和CTLA-4Aptamer的PLGA-S-S-PEG纳米颗粒取一定量的PLGA-S-S-PEG，按一定比例加入siRNA和DSPE-PEG-Aptamer，采用薄膜水化法制备内部负载siRNA表层连有Aptamer的纳米颗粒。本专利技术还提供了上述CTLA-4Aptamer靶向共负载PD-1siRNA纳米颗粒在制备抗肿瘤或抗癌药物中的应用。本专利技术的有益效果体现在：本专利技术提供了一种CTLA-4Aptamer靶向共负载PD-1siRNA纳米颗粒，将CTLA-4Aptamer、PD-1siRNA共负载于纳米递送体系，通过纳米颗粒表层的CTLA-4Aptamer靶向介导，可靶向CTLA-4配体细胞，同时与共负载的PD-1siRNA联合作用于同一免疫细胞，尤其Treg细胞，促进协同免疫反应的产生。本专利技术的CTLA-4Aptamer靶向共负载PD-1siRNA纳米颗粒与单独的CTLA-4Aptamer与PD-1siRNA的联合应用相比，能够大大提高CTLA-4Aptamer与PD-1siRNA的联合免疫治疗效果。附图说明为了更清楚地说明本专利技术具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。在所有附图中，类似的元件或部分一般由类似的附图标记标识。附图中，各元件或部分并不一定按照实际的比例绘制。图本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种CTLA-4Aptamer靶向共负载PD-1siRNA纳米颗粒，其特征在于，包括纳米载体和负载于其上的活性成分，所述活性成分包括CTLA-4Aptamer和PD-1siRNA。/n

【技术特征摘要】
1.一种CTLA-4Aptamer靶向共负载PD-1siRNA纳米颗粒，其特征在于，包括纳米载体和负载于其上的活性成分，所述活性成分包括CTLA-4Aptamer和PD-1siRNA。


2.根据权利要求1所述的CTLA-4Aptamer靶向共负载PD-1siRNA纳米颗粒，其特征在于，所述CTLA-4Aptamer通过吸附或化学键连接分布于所述纳米载体的表层。


3.根据权利要求1所述的CTLA-4Aptamer靶向共负载PD-1siRNA纳米颗粒，其特征在于，所述PD-1siRNA通过包载分布于所述纳米载体的内部和/或通过吸附分布于所述纳米载体的表层。


4.根据权利要求1所述的CTLA-4Aptamer靶向共负载PD-1siRNA纳米颗粒，其特征在于，所述纳米载体由生物可吸收的聚合物与阳离子脂质(DOTAP)或其修饰物构成或由生物可吸收的聚合物、磷脂类化合物构成；所述磷脂类化合物为二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)或其修饰物、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)或其修饰物、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺(DPPE)或其修饰物、二肉豆蔻酰基磷脂酰乙醇胺(DMPE)或其修饰物、二月桂酰基磷脂酰乙醇胺(DLPE)或其修饰物中的一种或多种。


5.根据权利要求4所述的CTLA-4Aptamer靶向共负载PD-1siRNA纳米颗粒，其特征在于，所述生物可吸收的聚合物为PLGA、PLGA-S-S-PEG、PLGA-PEG、PCL-PEG、PCL-S-S-PEG中的至少一种。


6.权利要求1-5任意一项所述的CTLA-4Aptamer靶向共负载PD-1siRNA纳米颗粒的制备...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘兰霞，张静，刘丹，冷希岗，
申请(专利权)人：中国医学科学院生物医学工程研究所，
类型：发明
国别省市：天津;12