一种创制枯萎病抗性西瓜种质材料的方法技术

本发明专利技术涉及一种创制枯萎病抗性西瓜种质材料的方法，属于分子育种技术领域，首先针对西瓜的Clpsk1基因的第一个外显子，设计基于CRISPR/Cas9的sgRNA序列，然后构建含有编码所述sgRNA序列的DNA片段的pRGEB32‑CAS9‑gRNA‑Clpsk1载体；利用农杆菌介导法将基因编辑载体导入受体西瓜品种苏蜜1号，获得转化植株；对转化植株进行Clpsk1基因编辑检测和枯萎病抗性鉴定，所得阳性植株即为具有枯萎病抗性的西瓜种质材料。本发明专利技术方法可快速高效地获得西瓜抗病新种质，极大地缩短了育种周期，提高了育种效率，获得的材料不含有任何外源基因，除提高了西瓜抗枯萎病的能力，其他农艺性状不受影响。

A method of creating watermelon germplasm material resistant to Fusarium Wilt

【技术实现步骤摘要】
一种创制枯萎病抗性西瓜种质材料的方法
本专利技术涉及一种创制枯萎病抗性西瓜种质材料的方法，特别是一种利用CRISPR/Cas9技术定向敲除Clpsk1基因创制枯萎病抗性西瓜种质材料的方法，属于分子育种

技术介绍
西瓜(Citrulluslanatus(Thunb.)Mansfeld.etNakai)是一种重要的水果类作物，具有较高的经济价值，在世界范围内广泛种植。中国是西瓜主产国，产量占世界西瓜总产量的60％以上，居世界首位(杨念等，2017)。西瓜生产受到各种生物和非生物胁迫的影响。枯萎病是其中最为严重的病害，其病原菌是半知菌亚门尖孢镰刀菌西瓜专化型(Fusariumoxysporumf.sp.niveurn)，其危害可造成西瓜减产80％以上甚至绝产。嫁接技术是目前普遍采用的解决西瓜枯萎病抗性的方法，但因其技术要求、砧木品种选择、或嫁接瓜品质等因素不被部分西瓜种植大户和消费者接受。通过常规育种方法培育抗枯萎病西瓜新品种是解决西瓜连作障碍同时保持西瓜风味的最佳方案。但是，西瓜遗传基础狭窄，种质资源缺乏等因素限制了抗病品种的选育。基因编辑是近年来发展起来的可以对基因组完成精确修饰的一种技术，其关键步骤是利用工程核酸酶诱导基因组产生DNA双链断裂，进而激活细胞内源修复机制，实现对基因组的精确的修饰(替换、插入或缺失)。CRISPR/Cas9(ClusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeatsCRISPR-associated)是一项全新的基因编辑技术革命，相比ZFN(zinc-fingernucleases)和TALEN(transcriptionactivator-likeeffectornucleases)技术过程繁琐、细胞毒性和脱靶率高的缺点，CRISPR/Cas9技术具有载体构建简单易行，成本更低，多靶点的同时定点修饰，染色体大片段缺失，靶向效率更高，且成本更低的优势(周想春等，2016)。目前，该技术已被广泛应用于基因功能研究和作物改良中，如拟南芥(Feng等，2013)，水稻(Kim等，2019)、玉米(Liu等，2017)、油菜(Zhai等，2019)、高粱(Jiang等，2013)、小麦(Upadhyay等，2013)、西瓜(Tian等，2017，2018)等，为培育新品种带来了更多的可能性。现有的报道多集中在不同物种中的CRISPR/Cas9技术体系的建立，而关于提高作物抗病性的报道相对较少。Kim等(2019，Rice,12:67)利用CRISPR/Cas9技术对水稻Os8N3基因进行了靶向突变，提高了水稻对稻黄单胞菌(Xanthomonasoryzaepv.oryzae)的抗性；Wang等(2019，PlantBiotechnologyReports)通过编辑CsWRKY22基因，降低了柑橘对溃疡病菌(Xanthomonascitrisubsp.citri)的敏感性；Tian等(2018，PlantCellReports，37:1353-1356)获得了抗除草剂的西瓜株系。然而，目前尚没有利用CRISPR/Cas9技术精准地创制枯萎病抗性西瓜种质材料的方法。
技术实现思路
为了解决
技术介绍
中提及的上述技术问题，本专利技术提供了一种创制枯萎病抗性西瓜种质材料的方法。技术方案一种创制枯萎病抗性西瓜种质材料的方法，包括如下步骤：(1)针对西瓜的Clpsk1基因(序列如SEQIDNO.1所示)的第一个外显子，设计基于CRISPR/Cas9的sgRNA序列，所述sgRNA作用位点的核苷酸序列为5’-CTCTCTTCTTTTCCTCTGTC-3’(SEQIDNO.2)；(2)构建含有编码所述sgRNA序列的DNA片段的pRGEB32-CAS9-gRNA-Clpsk1载体；(3)利用农杆菌介导法将pRGEB32-CAS9-gRNA-Clpsk1基因编辑载体导入受体西瓜品种苏蜜1号，获得转化植株；(4)转化植株用Cas9基因和潮霉素基因的特异性引物进行第一轮扩增，同时扩增出Cas9基因和潮霉素基因的植株，再用Clpsk1基因靶标序列侧翼引物进行第二轮扩增，将PCR产物进行测序，通过峰图筛选出sgRNA作用位点发生突变的植株，即为突变体植株；(5)将步骤(4)中鉴定出的突变体植株的T0代株系，自交收获T1代种子，用枯萎病菌孢子悬浮液侵染T1代植株，表现为抗病的植株即为具有枯萎病抗性的西瓜种质材料。进一步，步骤(2)中，pRGEB32-CAS9-gRNA-Clpsk1载体的构建方法，包括以下步骤：1)pRGEB32-AtU6载体的构建人工合成含有AtU6.3启动子序列、两个BsaI酶切位点以及一个gRNA重复区的片段，即为AtU6.3启动子片段，片段大小252bp；以质粒pBI121为模板，设计引物35sF，35sR，扩增2x35s启动子序列，得到35s启动子片段，片段大小930bp；通过融合PCR将AtU6.3和2x35s两个启动子片段进行融合，得到PCR融合产物；采用NcoI和HindIII对pRGEB32质粒、PCR融合产物进行双酶切和酶连，获得载体pRGEB32-AtU6；2)pRGEB32-CAS9-gRNA-Clpsk1载体的构建以CRISPR-P软件对西瓜基因组进行分析，获得gRNA编辑位点，分别设计AtU6F、AtU6R、ClPSK1-gRNAR和ClPSK1-gRNAF引物，以质粒pGTR为模板进行PCR扩增，分别获得AtU6.3和ClPSK1-gRNA的目的片段，长度分别为127bp和210bp；以BsaI酶切pRGEB32-AtU6载体骨架，利用GibsonMix进行载体骨架和目的片段的重组，将目的片段插入到载体pRGEB32-AtU6骨架中，构建得到pRGEB32-CAS9-gRNA-Clpsk1载体，pRGEB32-CAS9-gRNA-Clpsk1载体的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示；所述构建方法中，所用引物序列如下：2x35sF：5’-TGCATGCCTGCAGGTCCGCATGCCTGCAGGTCAACATG-3’(SEQIDNO.4)，2x35sR：5’-TAGTCCATGGCTCGAGTATCGTTCGTAAATGGTGAAAATTTTCA-3’(SEQIDNO.5)，AtU6F：5’-CGCCAAGCTTTGATCAAAAGTCCCACATCGATCA-3’(SEQIDNO.6)，AtU6R：5’-GACCTGCAGGCATGCACGC-3’(SEQIDNO.7)，ClPSK1-gRNAF：5’-TAGGTCTCGAAAAGAAGAGAGGTTTTAGAGCTAGAAATAG-3’(SEQIDNO.8)，ClPSK1-gRNAR：5’-ATGGTCTCGTTTTCCTCTGTCTGCACCAGCCGGGAA-3’(SEQIDNO.9)。进一步，步骤(3)中，获得转化植株的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种创制枯萎病抗性西瓜种质材料的方法，其特征在于，包括如下步骤：/n(1)针对西瓜的Clpsk1基因的第一个外显子，设计基于CRISPR/Cas9的sgRNA序列，所述sgRNA作用位点的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；/n(2)构建含有编码所述sgRNA序列的DNA片段的pRGEB32-CAS9-gRNA-Clpsk1载体；/n(3)利用农杆菌介导法将pRGEB32-CAS9-gRNA-Clpsk1基因编辑载体导入受体西瓜品种苏蜜1号，获得转化植株；/n(4)转化植株用Cas9基因和潮霉素基因的特异性引物进行第一轮扩增，同时扩增出Cas9基因和潮霉素基因的植株，再用Clpsk1基因靶标序列侧翼引物进行第二轮扩增，将PCR产物进行测序，通过峰图筛选出sgRNA作用位点发生突变的植株，即为突变体植株；/n(5)将步骤(4)中鉴定出的突变体植株的T0代株系，自交收获T1代种子，用枯萎病菌孢子悬浮液侵染T1代植株，表现为抗病的植株即为具有枯萎病抗性的西瓜种质材料。/n

【技术特征摘要】
1.一种创制枯萎病抗性西瓜种质材料的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)针对西瓜的Clpsk1基因的第一个外显子，设计基于CRISPR/Cas9的sgRNA序列，所述sgRNA作用位点的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示；
(2)构建含有编码所述sgRNA序列的DNA片段的pRGEB32-CAS9-gRNA-Clpsk1载体；
(3)利用农杆菌介导法将pRGEB32-CAS9-gRNA-Clpsk1基因编辑载体导入受体西瓜品种苏蜜1号，获得转化植株；
(4)转化植株用Cas9基因和潮霉素基因的特异性引物进行第一轮扩增，同时扩增出Cas9基因和潮霉素基因的植株，再用Clpsk1基因靶标序列侧翼引物进行第二轮扩增，将PCR产物进行测序，通过峰图筛选出sgRNA作用位点发生突变的植株，即为突变体植株；
(5)将步骤(4)中鉴定出的突变体植株的T0代株系，自交收获T1代种子，用枯萎病菌孢子悬浮液侵染T1代植株，表现为抗病的植株即为具有枯萎病抗性的西瓜种质材料。


2.如权利要求1所述创制枯萎病抗性西瓜种质材料的方法，其特征在于，步骤(2)中，pRGEB32-CAS9-gRNA-Clpsk1载体的构建方法，包括以下步骤：
1)pRGEB32-AtU6载体的构建
人工合成含有AtU6.3启动子序列、两个BsaI酶切位点以及一个gRNA重复区的片段，即为AtU6.3启动子片段，片段大小252bp；以质粒pBI121为模板，设计引物35sF，35sR，扩增2x35s启动子序列，得到35s启动子片段，片段大小930bp；通过融合PCR将AtU6.3和2x35s两个启动子片段进行融合，得到PCR融合产物；采用NcoI和HindIII对pRGEB32质粒、PCR融合产物进行双酶切和酶连，获得载体pRGEB32-AtU6；
2)pRGEB32-CAS9-gRNA-Clpsk1载体的构建
以CRISPR-P软件对西瓜基因组进行分析，获得gRNA编辑位点，分别设计AtU6F、AtU6R、ClPSK1-gRNAR和ClPSK1-gRNAF引物，以质粒pGTR为模板进行PCR扩增，分别获得AtU6.3和ClPSK1-gRNA的目的片段，长度分别为127bp和210bp；以BsaI酶切pRGEB32-AtU6载体骨架，利用GibsonMix进行载体骨架和目的片段的重组，将目的片段插入到载体pRGEB32-AtU6骨架中，构建得到pRGEB32-CAS9-gRNA-Clpsk1载体，pRGEB32-CAS9-gRNA-Clpsk1载体的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。


3.如权利要求2所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：张曼，羊杏平，徐锦华，刘广，姚协丰，任润生，徐建，娄丽娜，
申请(专利权)人：江苏省农业科学院，
类型：发明
国别省市：江苏;32