用于快速筛选重组菌株的重组表达载体及应用制造技术

本发明专利技术属于农业生物技术领域，具体涉及一种用于快速筛选高表达菌株的重组表达载体和快速筛选高表达菌株的方法。本发明专利技术将一个外源的红色荧光蛋白和烟曲霉细胞表面蛋白定位信号融合表达，将该融合基因(DsRed‑AfMP1)整合到里氏木霉基因组中，从而构建里氏木霉表面展示红色荧光蛋白的菌株。将表面展示红色荧光蛋白的里氏木霉菌株通过流式细胞仪分选，可以快速分离出有益于纤维素酶活提高的基因变化。

Recombinant expression vector for rapid screening of recombinant strains and its application

【技术实现步骤摘要】
用于快速筛选重组菌株的重组表达载体及应用
本专利技术属于农业生物
，具体涉及一种用于快速筛选重组菌株的重组表达载体及应用。
技术介绍
植物细胞壁主要由纤维素(cellulose)、半纤维素(hemicellulose)和木质素(lignin)组成。其中，纤维素作为构建细胞壁的主要成分，是一种由8,000-10,000个葡萄糖通过β-l,4-糖苷键连接而形成的天然线性大分子聚合物，以纤维二糖为其基本单元。将植物细胞壁中的纤维素多糖降解为可发酵的简单寡糖和单糖如葡萄糖需要复杂的纤维素酶酶系协同作用。里氏木霉作为主要的丝状真菌之一，具有强大的分泌纤维素酶的能力。工业上，经改造的里氏木霉，其产纤维素酶的产量可达到100g/L以上，因此，在降解植物细胞壁多糖以及相关应用上具有重要的应用价值。里氏木霉的纤维素酶系包括两个外切纤维素酶、五个内切纤维素酶、一个β-葡萄糖苷酶和三个裂解性多糖单加氧酶(lyticpolysaccharidesmonooxygenases,LPMOs，即原GH61家族成员)。随着里氏木霉遗传操作体系的不断优化，其转化效率已经可以基本满足工业的需要，但当得到大量的转化子时，如何筛选高效表达目的蛋白的转化子成了问题的关键。里氏木霉为丝状真菌，不同于常见的单一纯系菌落，里氏木霉为多核的菌落为多核菌丝相互缠绕形成的菌团结构。为了在高假阳性背景的转化平板上获得纯系转化子，只能通过繁琐的单孢分离过程分离单核孢子，导致遗传改造周期过长，进而导致筛选高表达量的菌株更加费时费力。流式细胞仪技术(Flowcytometry)是一种对处在液流中的单个细胞或其它生物颗粒等进行快速定量分析和分选的技术。流式细胞仪可以高速分析上万个细胞，同时从一个细胞中测得多个细胞特征参数，进行定性或定量分析，具有速度快、精度高、准确性好等特点。但是现有的流式检测技术只能检测到作用于转录阶段的调控因子变化，而无法检测转录阶段后期的调控因子变化。里氏木霉纤维素酶通过转录、翻译、转运和糖基化修饰等多个关键环节后进行分泌表达，而非胞内表达。因此，现有的只能检测转录水平变化的流式检测技术不能满足筛选酶活提高的纤维素酶的要求。
技术实现思路
为了解决现有技术中存在的无法快速筛选酶活提高的里氏木霉转化子的问题，本申请提供一种用于快速筛选重组菌株的重组表达载体和快速筛选及应用，本专利技术能够快速筛选里氏木霉纤维素酶高产菌株，大大缩短了筛选时间，提高了筛选的工作效率，获得高产量纯系转化子，以适应实际生产的需要。本专利技术的目的在于提供一种用于快速筛选高表达菌株的重组表达载体。本专利技术的再一目的在于提供一种含有上述重组表达载体的重组菌株。本专利技术的再一目的在于提供快速筛选高表达纤维素酶的里氏木霉的方法。本专利技术的再一目的在于提供一种快速筛选高表达纤维素酶且高酶活的里氏木霉的方法。根据本专利技术具体实施方式，用于快速筛选高表达菌株的重组表达载体，在所述重组表达载体的基因表达盒中由上游到下游依次包括元件：cbh1启动子、红色荧光蛋白基因DsRed、细胞表面蛋白锚定信号肽基因AfMp1及cbh1终止子，其中，DsRed基因的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示，AfMp1基因的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。cbh1启动子的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示：TcaacctttggcgtttccctgattcagcgtacccgtacaagtcgtaatcactattaacccagactgaccggacgtgttttgcccttcatttggagaaataatgtcattgcgatgtgtaatttgcctgcttgaccgactggggctgttcgaagcccgaatgtaggattgttatccgaactctgctcgtagaggcatgttgtgaatctgtgtcgggcaggacacgcctcgaaggttcacggcaagggaaaccaccgatagcagtgtctagtagcaacctgtaaagccgcaatgcagcatcactggaaaatacaaaccaatggctaaaagtacataagttaatgcctaaagaagtcatataccagcggctaataattgtacaatcaagtggctaaacgtaccgtaatttgccaacggcttgtggggttgcagaagcaacggcaaagccccacttccccacgtttgtttcttcactcagtccaatctcagctggtgatcccccaattgggtcgcttgtttgttccggtgaagtgaaagaagacagaggtaagaatgtctgactcggagcgttttgcatacaaccaagggcagtgatggaagacagtgaaatgttgacattcaaggagtatttagccagggatgcttgagtgtatcgtgtaaggaggtttgtctgccgatacgacgaatactgtatagtcacttctgatgaagtggtccatattgaaatgtaagtcggcactgaacaggcaaaagattgagttgaaactgcctaagatctcgggccctcgggccttcggcctttgggtgtacatgtttgtgctccgggcaaatgcaaagtgtggtaggatcgaacacactgctgcctttaccaagcagctgagggtatgtgataggcaaatgttcaggggccactgcatggtttcgaatagaaagagaagcttagccaagaacaatagccgataaagatagcctcattaaacggaatgagctagtaggcaaagtcagcgaatgtgtatatataaaggttcgaggtccgtgcctccctcatgctctccccatctactcatcaactcagatcctccaggagacttgtacaccatcttttgaggcacagaaacccaatagtcaaccgcggactgcgcatcatgtatcggaagttggccgtcatctcggccttcttggccacagctcgtgctDsRed基因的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示：ggcggctccggctccggctccggctccagcactggtactgccactgcctccaccagcaccaacctcctcAAGactggcgccgccagcaaggagcacttcagctactccctcggcggtgccgtcgtcgcggccgccatcgccgtcgctctctaaAfMp1基因的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示：Atggacaacaccgaggacgtcatcaaggagttcatgcagttcaaggtgcgcatggagggctccgtgaacggccactacttcgagatcgagggcgagggcgagggcaagccctacgagggcacccagaccgccaagctg本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于快速筛选高表达纤维素酶的里氏木霉的重组表达载体，其特征在于，在所述重组表达载体的基因表达盒中由上游到下游依次包括元件：cbh1启动子、红色荧光蛋白基因DsRed、细胞表面蛋白锚定信号肽基因AfMp1及cbh1终止子，其中，DsRed基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，AfMp1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于快速筛选高表达纤维素酶的里氏木霉的重组表达载体，其特征在于，在所述重组表达载体的基因表达盒中由上游到下游依次包括元件：cbh1启动子、红色荧光蛋白基因DsRed、细胞表面蛋白锚定信号肽基因AfMp1及cbh1终止子，其中，DsRed基因的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示，AfMp1基因的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。


2.含有权利要求1所述的用于快速筛选高表达纤维素酶的里氏木霉的重组表达载体的重组里氏木霉。


3.权利要求1所述的用于快速筛选高表达纤维素酶的里氏木霉的重组表达载体的应用。


4.快速筛选重组里氏木霉的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)将含有元件cbh1启动子、红色荧光蛋白基因DsRed、细胞表面蛋白锚定信号肽基因AfMp1及cbh1终止子的基因表达盒导入质粒中，得到重组表达载体，其中，DsRed基因的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示，AfMp1基因的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示；
(2)用步骤(1)构建的重组表达载体转化宿主细胞，得到重组菌株；
(3)培养重组菌株，诱导红色荧光蛋白表达于重组菌株的表面；
(4)筛选展示红色荧光的重组菌株。


5.根据权利要求4所述的快速筛选重组里氏木霉的方法，其特征在于，在步骤(4)中，用流式细胞仪筛选表面展示红色荧光的重组菌株。


6.快速筛选高表达纤维素酶且高酶活的里氏木霉的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)将含有元件cbh1启动子、红色荧光蛋白基因DsRed、细胞表面蛋白锚定信号肽基因AfMp1及cbh1终止子的基因表达盒导入质粒中，得到重组表达载体，其中，DsRed基因的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示，AfMp1基因的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示；
(2)用步骤(1)构建的重组表达载体转化宿主细胞，得到重组里氏木霉；
(3)向步骤(2)得到的所述重组里氏木霉中导入蛋白...

【专利技术属性】
技术研发人员：姚斌，苏小运，高飞，罗会颖，黄火清，柏映国，王苑，涂涛，王亚茹，孟昆，
申请(专利权)人：中国农业科学院饲料研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11