一种基于微流体技术制备单分散冻干微气泡的方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种基于微流体技术制备单分散冻干微气泡的方法及其应用。该方法通过微流体快速乳化技术获得尺寸可控的单分散乳液；所得单分散乳液进行冷冻干燥后，所得到中空微球即为微气泡的前驱体；将空心微球与缓冲溶液混合后，即得到单分散微气泡溶液。本方法利用微流体乳化技术制备中空微球作为微气泡的前驱体，所得微气泡冻干粉方便运输和保存，在使用时，不受仪器、场地和使用人员技术背景等要求的限制，所得到的微气泡尺寸均一，且可通过微流体技术调节微气泡的尺寸和内核的气体种类。在动物临床实验中，本发明专利技术的单分散冻干微气泡体现出比传统的多分散微气泡造影剂更强的造影效果。本发明专利技术的实验可控性强，所得微气泡的应用领域广。

A method of preparing monodisperse freeze-drying microbubbles based on microfluidic technology and its application

【技术实现步骤摘要】
一种基于微流体技术制备单分散冻干微气泡的方法及其应用
本专利技术属于生物材料应用
，具体涉及一种基于微流体技术制备单分散冻干微气泡的方法及其应用。
技术介绍
微米级的微气泡(直径1-10m)在心血管系统及浅层内脏疾病、肿瘤诊断中一直受到广泛的应用(KanakaHettiarachchietalLabChip,7,463–468(2007))。和传统的化学制剂为主的超声显影剂比起来，微气泡不仅无毒无副作用，而且能提供更清楚的显影对比和更高的信噪比。在某些特殊的病例中，例如心室裂缝的诊断，传统的化学超声显影剂很难发现病灶，而微气泡超声显影剂却能提供明显的造影效果(MehmetKayaetal,BubbleSciEngTechnol.2(2),33–40(2010))。如今，微气泡超声显影剂已经取代了传统的化学显影剂，成为了欧美医疗市场上的主流超声显影剂。目前商业化的微气泡显影剂的主要制剂形式是冻干微胶囊，加水搅拌后能形成大量的微气泡，从而得到可以进行血液注射的微气泡溶液。当微气泡随血液循环流经超声波探测区域的时候，由于微气泡(气体)和周边组织(液体和固体)的声学反射性质的较大区别，我们可以清楚地识别微气泡的分布。尤其是当超声波的频率接近微气泡自身的共振频率时，微气泡能提供极强的反射信号对比(HangyuLin,etal,MedBiolEngComput54,1317–1330(2016))。时至今日，微气泡超声显影剂的全球市场规模已经超过了30亿美元，并保持了26％的年均增长率(GlobalMicrobubbles/UltrasoundContrastAgentsMarketOutlook:2015-2021)。然而，目前市面上的商品化微气泡医疗超声显影剂依然有诸多不足。首先，现在的微气泡医疗造影剂使用的微气泡全部是多分散微气泡，即气泡的大小不同，尺寸分布范围从1微米到10微米不等。而微气泡的超声共振频率与其本身的尺寸成反比关系(共振频率*气泡半径≈3m/s)，大小不同的微气泡的超声共振频率差异很大(YoonjeePark,etal；Langmuir2012,28,3766-3772)。在实际的诊断中，多分散微气泡造影剂中实际上只有很少的一部分微气泡处于超声谐振波段，这不仅降低了信号反射的强度，降低了信噪比，也增加了气泡破裂融合从而堵塞血管的风险，而且使得造影剂的生产和使用变得低效和浪费。现有的的技术专利技术也存在不同的缺陷。例如申请号201610002404.3和申请号201620004350.X都公开了一种生产微气泡的微流控芯片专利技术。它们都可以通过向微通道内注入气体和液体的方法，调节液体流量和气体压强，实时生成微气泡。与本专利相比，它们的局限在于(1)微流体芯片的运行和维护需要使用者具备一定的专业知识技术背景和技术操作能力，(2)单一通道微流体芯片的微气泡的制备效率低下，据文献报道，制备直径5微米的微气泡的单通道微流体芯片的生产速率为每秒一百万个(LabonaChip11(12),2023-2029)，则制备1mL含有109个微气泡的溶液需要15～20分钟，难以响应临床应用的即时需求；(3)利用传统的微流体方法生产微气泡难以做到独立调节微气泡的大小和浓度，这是因为微气泡的尺寸与流体的流量成负相关关系，要制备较小的微气泡必须要较高的液体流量，从而带来较低的气泡浓度，而在实际的超声造影应用中，较低的气泡浓度通常难以提供有效的声学反射；(4)鉴于微流体实际生产微气泡的低速率，在漫长的制备、收集、转移和运输过程中，微气泡的稳定性通常也会收到影响，进一步地降低了微气泡的产率和使用效果。
技术实现思路
针对现有技术的种种不足，本专利技术的目的在于提供一种基于微流体技术制备单分散冻干微气泡的方法及其应用，该方法利用微流体乳化技术制备单分散乳液作为微气泡前驱体，脂质体作为微气泡外壳材料，得到了单分散的冻干微气泡。与市面上其他的商品化微气泡显影剂相比，该方法的主要优势为(1)所制得的微气泡尺寸均一性高，且可通过微流体技术进行调节气泡大小(2)超声显影的增强效果更好。与其他的通过微流体技术直接制备微气泡的专利专利技术相比，该方法的主要优势在于(1)对使用者无技术背景要求，(2)在临床使用中无需等待微气泡的生产，冻干粉微气泡可以即溶即用，(3)微气泡的浓度和大小可以独立调控，(4)冻干微气泡粉的稳定性好，在长期的存储后也可以即时使用，(5)微气泡内核的气体种类可以为某一种气体或者数种气体的混合物，且选择范围广泛。为解决现有技术问题，本专利技术采取的技术方案为：一种基于微流体技术制备单分散冻干微气泡的方法，包括以下步骤：步骤1，制备微流体芯片组装微流体芯片或玻璃毛细管组装成的液滴生成装置；步骤2，制备单分散乳液利用机械泵或者气压泵作为驱动，将含有表面活性剂的水溶液和溶有脂质体的三氯甲烷溶液分别从水相入口和油相入口注入微流体芯片，其中水溶液中含有体积分数2.5％的Pluronic-F68表面活性剂，三氯甲烷溶液中含有质量分数0.1％-1％的脂质体，水相流量为1-50ml/hr，油相流量为0.1-10ml/hr，水相流量与油相流量的比例为1/5-1/20，调节水相流量与油相流量的流量比，可制得直径为5-50μm且均一分布的油/水乳液；其中，脂质体由于自身的两亲性会分布在油/水乳液的界面；步骤3，冷冻干燥对步骤2所得的油/水乳液进行收集和静置分离，撇去上层的水溶液，将剩余的乳液移入冻干机，在-80℃下超低温干燥，得到由脂质体包裹的中空微球，即单分散冻干微气泡。作为改进的是，所述微流体芯片为PDMS微流体芯片，所述PDMS微流体芯片的制备方法，包括以下步骤：第一步，利用工程制图软件AutoCAD设计深度为50微米，宽度为50微米的微流体管道，并在透明塑料薄片上印刷为光刻模板，所述微流体管道有一个水相入口、一个油相入口和一个产物收集出口，所述水相入口和油相入口的口径为1mm；第二步，使用软光刻技术将光刻模板打印在硅片基板上，光刻模板上的图案在硅片基板的投影尺寸比为1:1；第三步，揭模将PDMS硅胶均匀涂抹于硅片基板上，层厚度为5mm,使用真空泵充分消除硅胶中残留的气泡之后，将硅胶移入70℃的烘箱中加热1小时，揭模后即得管道，且硅片基板可以重复使用来进行揭模；第四步，键合将微流体管道和玻璃基板放入等离子体反应箱中，使用紫外光照射表面1分钟后，使得A材料和玻璃基板表面充分羟基化，反应结束后迅速取出微流体管道和玻璃基板，使二者表面轻轻接触即可完成粘合，得到微流体芯片。作为改进的是，步骤2和步骤3中脂质体的具体成分：每100mg脂质体中含有60mg,的1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine(1,2-二十六烷酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱)；10mg的1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphate，sodiumsalt(1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于微流体技术制备单分散冻干微气泡的方法，其特征在于，包括以下步骤：/n步骤1，制备微流体芯片/n组装微流体芯片或玻璃毛细管组装成的液滴生成装置；/n步骤2，制备单分散乳液/n利用机械泵或者气压泵作为驱动，将含有表面活性剂的水溶液和溶有脂质体的三氯甲烷溶液分别从水相入口和油相入口注入微流体芯片，其中水溶液中含有体积分数2.5％的Pluronic-F68表面活性剂，三氯甲烷溶液中含有0.1％-1％质量分数的脂质体，水相流量为1-50ml/hr，油相流量为0.1-10ml/hr，水相流量与油相流量的比例为1/5-1/20，通过调节水相流量与油相流量的流量比，可制得直径为5微米至50微米且均一分布的油/水乳液；其中，脂质体由于自身的两亲性会分布在油/水乳液的界面；/n步骤3，冷冻干燥/n对步骤2所得的油/水乳液进行收集和静置分离，撇去上层的大部分水溶液，将剩余的乳液移入冻干机，在-80℃下超低温干燥，得到由脂质体包裹的中空微球，即单分散冻干微气泡。/n

【技术特征摘要】
1.一种基于微流体技术制备单分散冻干微气泡的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1，制备微流体芯片
组装微流体芯片或玻璃毛细管组装成的液滴生成装置；
步骤2，制备单分散乳液
利用机械泵或者气压泵作为驱动，将含有表面活性剂的水溶液和溶有脂质体的三氯甲烷溶液分别从水相入口和油相入口注入微流体芯片，其中水溶液中含有体积分数2.5％的Pluronic-F68表面活性剂，三氯甲烷溶液中含有0.1％-1％质量分数的脂质体，水相流量为1-50ml/hr，油相流量为0.1-10ml/hr，水相流量与油相流量的比例为1/5-1/20，通过调节水相流量与油相流量的流量比，可制得直径为5微米至50微米且均一分布的油/水乳液；其中，脂质体由于自身的两亲性会分布在油/水乳液的界面；
步骤3，冷冻干燥
对步骤2所得的油/水乳液进行收集和静置分离，撇去上层的大部分水溶液，将剩余的乳液移入冻干机，在-80℃下超低温干燥，得到由脂质体包裹的中空微球，即单分散冻干微气泡。


2.根据权利要求1所述的一种基于微流体技术制备单分散冻干微气泡的方法，其特征在于，所述微流体芯片为PDMS微流体芯片，所述PDMS微流体芯片的制备方法，包括以下步骤：
第一步，利用工程制图软件AutoCAD设计深度为50微米，宽度为50微米的微流体管道，并在透明塑料薄片上印刷为光刻模板，所述微流体管道有一个水相入口、一个油相入口和一个产物收集出口，所述水相入口和油相入口的口径为1mm；
第二步，使用软光刻技术将光刻模板打印在硅片基板上，光刻模板上的图案在硅片基板的投影尺寸比为1:1；
第三步，揭模
将PDMS硅胶均匀涂抹于硅片基板上，层厚度为5mm,使用真空泵充分消除硅胶中残留的气泡之后，将硅胶移入70℃的烘箱中加热1小时，揭模后即得管道，且硅片基板可以重复使用来进行揭模；
第四步，键合
将微流体管道和玻璃基板放入等离子体反应箱中，使用紫外光照射表面1分钟后，使得A材料和玻璃基板表面充分羟基化，反应结束后迅速取出微流体管道和玻璃基板，使二者表面轻轻接触即可完成粘合，得到微流体芯片。


3.根据权利要求1所述的一种基于微流体技术制备单分散冻干微气泡的方法，其特征在于，步骤2和步骤3中脂质体的具体成分：每100mg脂质体中含有60mg,的1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine(1,2-二十六烷酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱)；10mg的1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphate，sodiumsalt(1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐江，张磊，
申请(专利权)人：湖州里应生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33