一种特殊膳食蛋白质的生产方法与应用技术

本发明专利技术提供了一种特殊膳食蛋白质的生产方法与应用。以芽孢杆菌来源的蛋白酶蛋白序列作为模板，进行苯丙氨酸的敲除替换，并进行部分氨基酸的重排，从而保证无苯丙氨酸蛋白在发酵过程中具有蛋白酶特异性活力，降解掉其他杂蛋白或者抑制其他杂蛋白的生长；采用补料发酵工艺延长菌种对数生长期时间，提高蛋白表达量，同时对后处理工艺进行优化，得到的蛋白粉纯度高，口感佳。获得的重组无苯丙氨酸蛋白中LNAA与Phe的比值超过100倍，可有效降低血液中的苯丙氨酸进入大脑。按照本专利方法生产无/低苯丙氨酸的蛋白粉的生产成本可降低至普通蛋白制品的价格，有巨大的实际应用价值和广阔的市场前景。

Production method and application of a special dietary protein

【技术实现步骤摘要】
一种特殊膳食蛋白质的生产方法与应用
本专利技术涉及基因工程领域，具体地涉及在地衣芽孢杆菌中的表达及生产苯丙酮尿症患者适用的重组蛋白质的方法，其中包括在设计重组蛋白时，以芽孢杆菌来源的蛋白酶蛋白序列作为模板，进行苯丙氨酸的敲除替换，并进行部分氨基酸的重排，从而保证新设计的无苯丙氨酸蛋白在发酵过程中是有蛋白酶活力的，在发酵后处理过程中，可经过简单处理使其蛋白酶活力永久性丧失，从而保证膳食蛋白的安全性。
技术介绍
苯丙酮尿症(phenylketonuria，PKU)是一种罕见的氨基酸代谢遗传病，在中国新生儿中的发病率约为1:11800，全国PKU患者总人数在12万人左右。PKU为常染色体隐性遗传，是由于苯丙氨酸代谢途径中的关键酶(PAH)或辅因子(BH4)缺失，使得苯丙氨酸不能转变成为酪氨酸，导致苯丙氨酸及其酮酸在脑和血浆中蓄积，也称高苯丙氨酸血症(HPA)，体内的苯丙氨酸主要从尿中排出。在患者出生3-4个月时就开始表现出来典型症状，一岁时症状明显。PKU的主要表现形式为各种毒性物质在大脑中累积，引起中枢神经系统的损害，影响人们思考、感受和行为方式，其主要表现为生长及智力发育迟缓、抽搐、反射亢进、湿疹和鼠气味等，如不及时治疗，可造成智力低下大多数国家通常会对出生后的新生儿进行筛查。如果在生命早期未被发现和未及时治疗，PKU会导致婴儿神经系统不可逆转的损害、严重的智力迟钝和大脑发育不良。据报道，如果不及时治疗，婴儿在出生后的第一年就会损失智商。根据治疗开始时的年龄，不同年龄期间的血液Phe水平和膳食治疗PKU的依从性不可避免地会伴随着至少一些智商的丧失。一旦检测到，可通过向婴儿和之后的儿童提供Phe限制膳食来治疗该病症。苯丙酮尿症根据血液中苯丙氨酸的含量分为以下几个类型：当未经治疗时，血浆Phe浓度大于1200μmol/L的，称为经典型PKU(最严重的PKU)；未经治疗，血浆Phe浓度在600-1200μmol/L中间的，称为轻度型PKU；未经治疗，血浆Phe浓度在180-600μmol/L中间的，称为良性PKU(或非PKU-HPA)。具有经典型(或严重)PKU的个体必须采用基于极低Phe膳食的严格膳食方案进行治疗，以将其Phe浓度降低至安全范围。这种中等程度形式的PKU通过使用适度的膳食限制来管理，例如：相对低蛋白质的膳食，不需要补充无Phe的氨基酸配方。患有非PKU-HPA的个体通常不被治疗，因为他们被认为具有在“安全”范围内的血浆Phe水平。在膳食PKU治疗中，目标范围是<360μmol/L，高达600μmol/L的范围也被认为是可接受的。苯丙酮尿症(PKU)的目前的主要治疗途径有以下几种：1)饮食疗法通过控制摄入苯丙氨酸含量的膳食疗法来治疗苯丙酮尿症的历史最为悠久。早在20世纪50年代就开始了苯丙氨酸限制膳食治疗PKU，通过蛋白质水解的方式，然后通过肽的过滤步骤去除尽可能多的Phe后，向患者提供必需氨基酸(Phe除外)。基本要求为在保证人体正常生长发育所需的苯丙氨酸摄入量的基础上限制苯丙氨酸的摄入。为避免血液中苯丙氨酸浓度增高所致的脑神经不可逆损伤，PKU患者自新生儿期起就开始控制饮食，坚持终身治疗。传统的苯丙氨酸限制饮食疗法存在诸多的缺点：(1)由于大多数食物的蛋白质中都含有苯丙氨酸，所以能选择的食物非常受限，只能选择不含蛋白质或者含蛋白质很低的食物，导致病人的氮代谢紊乱，引发并发症，(2)以氨基酸复配粉作为饮食蛋白质的替代物，由于多种氨基酸均有很强的苦涩味以及特殊不愉快气味，导致氨基酸复配粉的口感差，患者治疗依从性较差；另外，由于口服大量游离氨基酸，导致肠道的渗透压紊乱，引发肠道不适以及肠道代谢紊乱；再次之，氨基酸粉能做成的食物形式非常有限，长期服用导致患者的生活质量下降。(3)由于生活质量差导致神经和心理问题不断；(4)饮食的长期受限制或选择单一导致营养缺乏；(5)特殊食品和营养素的花费较大，家庭负担较重。糖巨肽(Glycomacropeptide，GMP)是制作奶酪期间从乳清中提取的天然低苯丙氨酸蛋白质，也是目前苯丙酮尿症患者适用的唯一低苯丙氨酸的膳食蛋白质。纯GMP缺乏芳香族氨基酸苯丙氨酸(Phe；F)，但同时也缺乏酪氨酸(Tyr；Y)和色氨酸(Trp；W)以及精氨酸(Arg；R)、组氨酸(His；H)和半胱氨酸(Cys；C)等必需氨基酸和重要氨基酸。糖巨肽在乳汁中的含量较低，约占乳清蛋白的15-20％，除糖巨肽外，其他蛋白都是含有苯丙氨酸的，因此需要经过多步精细纯化才能得到较纯的糖巨肽，市场上销售的糖巨肽产品的苯丙氨酸含量约4mg/g[KyungwhaLim,MolecularGeneticsandMetabolism,(2007)]。然而，由于糖巨肽缺乏多种必需氨基酸，不能作为膳食蛋白质的唯一来源，因此需要复配其他必需氨基酸组合作为低苯丙氨酸饮食，由于其并不是完全无苯丙氨酸蛋白粉，因此其可以作为一种辅助疗法替代部分氨基酸饮食。另外，由于生产纯化工艺十分复杂，一般乳品厂无法大批量生产出合格的低苯丙氨酸的糖巨肽，所以市场售价昂贵，且市场占有率也很低。根据《中国居民膳食营养素参考摄入量(2013版)》的规定，苯丙酮尿症患者对膳食蛋白质的需求量为0.8-1.2g/kg·d，也就是每天需求总量15-75g，普通患者经济上很难支撑长期服用如此大量的糖巨肽蛋白产品。目前绝大多数的苯丙氨酸限制饮食的产品均为复配氨基酸粉。2)药物治疗沙丙蝶呤是BH4的药物形式，FDA于2007年12月26日批准BioMarinPharmaceutical研发生产的Kuvan上市，其主要针对的是四氢生物蝶呤(BH4)缺乏症所致的高苯丙氨酸血症(HPA)。BH4为孤儿药，价格偏高，在国内供应渠道较少。注射用PEG修饰的苯丙氨酸解氨酶(商品名：Palynziq)，FDA于2018年批准BioMarin制药公司用于成人治疗苯丙酮尿症。适用于那些使用已有治疗药物无法控制病情(血液苯丙氨酸浓度失控)的成年PKU患者。治疗苯丙酮尿症的药物为孤儿新药，价格昂贵，且并非对所有苯丙酮尿症患者有效，且长期使用，产生免疫原性导致效果逐渐变差。3)大分子中性氨基酸(LNAA)由于苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸及一些支链氨基酸等大的中性氨基酸(Largeneutralaminoacids)是通过共同的转运载体L-typeaminoacidtransporter(LAT1,SLC7A5)通过血脑屏障进入大脑的，因此，血液中苯丙氨酸过高会和其他的LNAA竞争转运载体，研究证实补充LNAA可以降低大脑中苯丙氨酸浓度，从而缓解高浓度苯丙氨酸对大脑神经的毒害和引起的智力障碍。LNAA的补充剂，同样面临着口服氨基酸的缺点，如苦涩味重，口感差，引起肠道不适以及肠道功能紊乱等。常见的优质食物蛋白质，如乳清蛋白，卵蛋白，大豆蛋白等，其苯丙氨酸含量均比较高(约3.1-5.35％)[ChristopherJ.Rasmussen,NutritionalSupplementsinSportsandExercise，(2008)；Mar本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种表达重组无苯丙氨酸蛋白PKU2的地衣芽孢杆菌重组工程菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：/n1)表达菌种中原始基因的敲除/n(1)敲除质粒的构建；/n以地衣芽孢杆菌CICC10266的基因组DNA为模板，用表1中的引物apr-up-F/apr-up-R，apr-down-F/apr-down-R，PCR扩增上游同源臂apr-up和下游同源臂apr-down，然后以apr-up-F/apr-down-R为引物，通过重叠PCR扩增apr-up+down，并用DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒回收PCR片段；以pEBKan194-GFP质粒为模板，用表1中的引物pEBKan194-F/pEBKan194-R，PCR扩增约5300bp的载体骨架片段，并用DpnI内切酶消化后DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒回收载体骨架片段，将载体骨架与up+down重叠片段进行组装，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选到的阳性菌株进行DNA测序确认，测序正确的阳性菌株用质粒提取试剂盒抽提质粒备用；该质粒命名为pEBKan194-GFP-apr-up+down；/n表1. pEBKan194-GFP-apr-up+down载体构建引物/n...

【技术特征摘要】
1.一种表达重组无苯丙氨酸蛋白PKU2的地衣芽孢杆菌重组工程菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)表达菌种中原始基因的敲除
(1)敲除质粒的构建；
以地衣芽孢杆菌CICC10266的基因组DNA为模板，用表1中的引物apr-up-F/apr-up-R，apr-down-F/apr-down-R，PCR扩增上游同源臂apr-up和下游同源臂apr-down，然后以apr-up-F/apr-down-R为引物，通过重叠PCR扩增apr-up+down，并用DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒回收PCR片段；以pEBKan194-GFP质粒为模板，用表1中的引物pEBKan194-F/pEBKan194-R，PCR扩增约5300bp的载体骨架片段，并用DpnI内切酶消化后DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒回收载体骨架片段，将载体骨架与up+down重叠片段进行组装，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选到的阳性菌株进行DNA测序确认，测序正确的阳性菌株用质粒提取试剂盒抽提质粒备用；该质粒命名为pEBKan194-GFP-apr-up+down；
表1.pEBKan194-GFP-apr-up+down载体构建引物








引物名称
引物序列(5’-3’)


apr-up-F
GACTCTAGAGGATCCctacaccctttcattgacagaatc


apr-up-R
CGTTTCTTTGCcgcttgatgaaatcagctcatgtgaaag


apr-down-F
cacatgagctgatttcatcaagcgGCAAAGAAACGATC


apr-down-R
GAGCTCGGTACCCGGaaagcggtatgctctatggac


pEBKan194-F
CCGGGTACCGAGCTCGAGGC


pEBKan194-R
GGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGC


PEBKan194-F(ce)
GTTTATGCATCCCTTAACCG


PEBKan194-R(ce)
TTTACCAGACAACCATTACCT


apr-F双
ctccatcaatgacaatgataatcattatc


apr-R双
gtacgccgttttaggagctc






(2)电击转化宿主菌：
I.制备地衣芽孢杆菌感受态细胞；
II.电击转化：将质粒pEBKan194-GFP-apr-up+down电击转化到地衣芽孢杆菌感受态细胞中，倒置于37℃培养箱过夜培养至长出单菌落；
(3)基因敲除菌株的筛选：
I.转化子鉴定：
在紫外灯下观察步骤(2)平板上长出的转化子，挑取有绿色荧光的菌落过夜培养，过夜培养的菌液，提取质粒，进行酶切分析，阳性菌株加入终浓度为20％的甘油冻存在-80℃冰箱；
II.单交换传代与筛选：
将过夜培养的阳性菌液，传代，从划线平板上挑取单菌落到含有卡那霉素的LB培养基中，振荡培养至菌液浑浊，菌液PCR筛选阳性菌株，用表1中的pEBKan194-F(ce)/apr-R双或apr-F双/pEBKan194-R(ce)引物对，对单菌落进行PCR验证并DNA测序确认；
III.双交换传代与筛选：
将单交换筛选为阳性的菌株，按0.2％的比例接种至LB培养基，每12h转接一次，如此转接2-3次，筛选抗性缺失株，用表1中的apr-F双/apr-R双为引物对，对单菌落进行PCR验证，敲除正确的菌株命名为CICC10266-1；
2)在原始基因敲除位点整合无苯丙氨酸蛋白基因
(1)编码无苯丙氨酸蛋白PKU2基因的合成
以芽孢杆菌来源的蛋白酶蛋白序列(Genebank：MK085119.1)作为模板，进行苯丙氨酸的敲除替换，并进行部分氨基酸的重排，获得无苯丙氨酸目的蛋白PKU2，其氨基酸序列如SEQIDNO：1所示，根据蛋白PKU2的序列和表达系统密码子偏好，设计并全基因合成表达基因(完整表达框)；
(2)...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋保平，刘海峰，李春艳，陈火晴，姚琦，
申请(专利权)人：深圳市诺维健生物技术有限责任公司，
类型：发明
国别省市：广东;44