一种小鼠或大鼠肾成纤维细胞分离及传代培养方法技术

本发明专利技术提出了一种小鼠或大鼠肾成纤维细胞分离及传代培养方法，本发明专利技术切取小鼠或大鼠的完整肾脏，用胰蛋白酶和IV型胶原酶联合消化，在完全培养基中培养5‑7d后经免疫荧光鉴定纯度可达95％以上，将分离的成纤维细胞用成纤维专用培养基传代培养，细胞增殖快、纯度高。本发明专利技术提出的一种小鼠或大鼠肾成纤维细胞分离及传代培养方法，取材方便，操作简单，细胞增殖快、得率高、纯度高，是一种理想的小鼠或大鼠肾成纤维细胞分离及传代培养方法，为实验提供可靠的细胞资源。

A method for isolation and subculture of mouse or rat renal fibroblasts

【技术实现步骤摘要】
一种小鼠或大鼠肾成纤维细胞分离及传代培养方法
本专利技术涉及原代细胞培养领域，尤其涉及一种小鼠或大鼠肾成纤维细胞分离及传代培养方法。
技术介绍
肾间质成纤维细胞是主要位于肾小囊和肾小管基膜，与肾小管周围毛细血管间形成结构支架的肾间质内细胞，功能旺盛，具有多种生物学功能。肾间质是肾泌尿小管之间的少量结缔组织，其中疏松结缔组织中的主要细胞成分是成纤维细胞。肾间质成纤维细胞受刺激而活化、增殖，细胞外基质堆积过多等，可造成肾损伤。肾纤维化是各种慢性肾脏病进展为终末期肾衰竭共同的病变过程，因此研究培养肾成纤维细胞作为各种肾脏病体外研究的细胞模型非常必要。但是目前国内研究这方面的相关文献较少，已有文献报道的小鼠或大鼠肾成纤维细胞分离培养方法大致包括如下步骤：1、切取小鼠或大鼠完整肾脏；2、分离肾髓质；3、用胰蛋白酶消化组织碎块；4、用完全培养基培养细胞。由于肾成纤维细胞在组织内含量较少，原代细胞分离提取难度大，导致常用的分离培养方法细胞得率极低，培养24h后获得多为肾小球、肾小管的上皮或内皮细胞，成纤维细胞极少，需长期培养才得到少量成纤维细胞，培养成功率低，且该方法重复性差，成本较高。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提出了一种小鼠或大鼠肾成纤维细胞分离培养方法，取材方便，操作简单，分离培养的小鼠或大鼠肾成纤维细胞得率高、增殖快、纯度高。本专利技术的技术方案是这样实现的：一方面，本专利技术提供了一种小鼠或大鼠肾成纤维细胞分离方法，包括以下步骤：S1、无菌获取出生1-30天的小鼠或大鼠的完整肾脏；S2、将步骤S1得到的肾脏用含1％(v/v)青霉素/链霉素双抗的磷酸盐缓冲液反复冲洗2-3次，将其剪成1-3mm3大小的组织块；S3、将组织块用3-5倍组织块体积的消化液进行消化；S4、终止消化，过细胞筛，离心，去上清，得到细胞沉淀；S5、将细胞沉淀用完全培养基重悬接种到培养皿内，置于37℃、5％CO2恒温培养箱静置培养，24h后更换新鲜培养基继续培养，之后每隔2-3d再更换一次培养基，培养5-7d即得到汇合度80％-90％的细胞；S6、接种步骤S5所述汇合度80％-90％的细胞，用胰蛋白酶消化后获得细胞悬液，接种爬片，进行Vimentin免疫荧光鉴定。在以上技术方案的基础上，优选的，步骤S1所述肾脏是小鼠或大鼠剥离肾包膜的双侧肾脏。在以上技术方案的基础上，优选的，步骤S3中所述消化液包括胰蛋白酶和IV型胶原酶。更进一步，优选的，所述胰蛋白酶浓度为0.05％-0.25％(w/v)，所述IV型胶原酶浓度为0.05％-0.2％(w/v)。在以上技术方案的基础上，优选的，步骤S3中所述消化条件为消化时间25-45min，消化温度37℃，水浴振荡消化。在以上技术方案的基础上，优选的，步骤S4中所述细胞筛目数为200目。在以上技术方案的基础上，优选的，步骤S4中所述离心转速为800-1500r/min，离心时间为3-8min。在以上技术方案的基础上，优选的，步骤S5中所述完全培养基为成纤维专用培养基或含10％(v/v)胎牛血清、1％(v/v)青霉素/链霉素双抗的DMEM培养基。另一方面，本专利技术还提供了一种小鼠或大鼠肾成纤维细胞传代培养方法，包括将步骤S5得到的所述汇合度80％-90％的细胞弃培养基后用磷酸盐缓冲液清洗，加入胰蛋白酶消化，于显微镜下观察细胞，待细胞皱缩变圆时，加入成纤维专用培养基终止消化，获得细胞悬液，以一瓶均分至多瓶传代，获得P2代细胞。本专利技术的小鼠或大鼠肾成纤维细胞分离及传代培养方法相对于现有技术具有以下有益效果：(1)本专利技术直接取小鼠或大鼠的完整肾脏组织分离成纤维细胞，取材容易，操作简单，耗时短；(2)相比使用单一的胰蛋白酶进行消化，本专利技术采用胰蛋白酶与IV型胶原酶联合消化，并探索了合适的消化时间，消化作用更温和，获得细胞损伤小、活性高、数量多；(3)采用本专利技术方法分离细胞培养24h后即可获得大量成纤维细胞，培养5-7d后，经免疫荧光鉴定纯度达95％以上，细胞纯度高。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为本专利技术分离培养方法培养5d的小鼠成纤维细胞显微镜图(100×)；图2为本专利技术分离培养方法得到的小鼠成纤维细胞Vimentin免疫荧光鉴定图(200×)；图3为本专利技术分离培养方法得到的小鼠P2代成纤维细胞显微镜图(100×)；图4为本专利技术分离培养方法培养24h的大鼠成纤维细胞显微镜图(200×)，图中黑色箭头指示大鼠成纤维细胞；图5为本专利技术分离培养方法培养5d的大鼠成纤维细胞显微镜图(100×)；图6为本专利技术分离培养方法得到的大鼠成纤维细胞Vimentin免疫荧光鉴定图(200×)。具体实施方式下面将结合本专利技术实施方式，对本专利技术实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式仅仅是本专利技术一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本专利技术中的实施方式，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本专利技术保护的范围。下面实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。本专利技术所用的试剂和原料均为公知技术，为本领域技术人员熟知的技术，而且在市场上很容易购得。下面实施例中描述的试剂和实验器具在使用前均经过灭菌处理。实施例1取出生30天的小鼠，雌雄皆可，按每只小鼠胸腔注射0.5mL10％水合氯醛，麻醉后，75％酒精浸泡5min消毒，转移至超净工作台内。用无菌剪刀从小鼠腹部正中剪开皮肤，打开腹腔，取出双侧肾脏，放入无菌培养皿内，加入适量含1％青霉素/链霉素双抗的磷酸盐缓冲液；用显微镊子剥离肾包膜，用含1％青霉素/链霉素双抗的磷酸盐缓冲液冲洗肾脏3次，将肾脏转移至1.5mLEP管内，用眼科剪剪碎肾脏组织，将组织剪至1mm3大小为止，加入500μL含1％青霉素/链霉素双抗的磷酸盐缓冲液，用移液枪将组织转移至15mL离心管内。向所述离心管内加入5倍组织体积的消化液，消化液包含0.25％胰蛋白酶、0.2％IV型胶原酶，由磷酸盐缓冲液溶解配制，将离心管放入水浴摇床，温度37℃，振荡消化，消化时间25min。消化完毕后，取出离心管反复吹打组织至无明显块状，组织液经200目细胞筛过滤，滤液经1200r/min离心5min，获得细胞沉淀。用成纤维专用培养基重悬细胞沉淀，接种于培养皿内，培养皿放置于37℃、5％CO2恒温培养箱中静置培养，24h后更换新鲜培养基，之后2d换液一次，培养5d细胞即生长至汇合度90％，即可进行传代培养，传代时用磷酸盐缓冲液清洗细胞1次，加入本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种小鼠或大鼠肾成纤维细胞分离方法，其特征在于，包括以下步骤：/nS1、无菌获取出生1-30天的小鼠或大鼠的完整肾脏；/nS2、将步骤S1得到的肾脏用含1％(v/v)青霉素/链霉素双抗的磷酸盐缓冲液反复冲洗2-3次，将其剪成1-3mm

【技术特征摘要】
1.一种小鼠或大鼠肾成纤维细胞分离方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、无菌获取出生1-30天的小鼠或大鼠的完整肾脏；
S2、将步骤S1得到的肾脏用含1％(v/v)青霉素/链霉素双抗的磷酸盐缓冲液反复冲洗2-3次，将其剪成1-3mm3大小的组织块；
S3、将组织块用3-5倍组织块体积的消化液进行消化；
S4、终止消化，过细胞筛，离心，去上清，得到细胞沉淀；
S5、将细胞沉淀用完全培养基重悬接种到培养皿内，置于37℃、5％CO2恒温培养箱静置培养，24h后更换新鲜培养基继续培养，之后每隔2-3d再更换一次培养基，培养5-7d即得到汇合度80％-90％的细胞；
S6、接种步骤S5所述汇合度80％-90％的细胞，用胰蛋白酶消化后获得细胞悬液，接种爬片，进行Vimentin免疫荧光鉴定。


2.如权利要求1所述的小鼠或大鼠肾成纤维细胞分离方法，其特征在于：步骤S1所述肾脏是小鼠或大鼠剥离肾包膜的双侧肾脏。


3.如权利要求1所述的小鼠或大鼠肾成纤维细胞分离方法，其特征在于：步骤S3中所述消化液包括胰蛋白酶和IV型胶原酶。


4.如权利要求3所述的小鼠或大鼠肾成纤维细胞分离方法，其特征在于：所...

【专利技术属性】
技术研发人员：冷毅斌，吴亭，尚振波，
申请(专利权)人：武汉普诺赛生命科技有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42