一种液相色谱串联质谱定量检测意蜂蜜中α-葡萄糖苷酶的方法技术

本发明专利技术提供一种液相色谱串联质谱定量检测意蜂蜜中α‑葡萄糖苷酶的方法，包括：筛选特征肽段，制作标准曲线，样品前处理，液相色谱分离以及串联质谱检测，软件定量肽段等步骤；所述特征肽段包括特征肽段1：SISNNEQVK和特征肽段2：IYTHDIPETYNVVR。本发明专利技术所提出的意蜂蜜中α‑葡萄糖苷酶的定量方法，具有较高的准确度、精确度和灵敏度，并且稳定性强，适用于准确定量意蜂蜜中α‑葡萄糖苷酶，可用于辅助意蜂蜜真实性评价。该定量方法对保护蜂蜜消费者的权益和维护蜂产品行业的健康发展具有重要现实意义。

A method for quantitative determination of \u03b1 - glucosidase in Italian honey by liquid chromatography tandem mass spectrometry

【技术实现步骤摘要】
一种液相色谱串联质谱定量检测意蜂蜜中α-葡萄糖苷酶的方法
本专利技术涉及食品检测领域，具体为一种液相色谱串联质谱定量检测意蜂蜜中α-葡萄糖苷酶的方法，该方法适用于意蜂蜜的真实性的鉴别与评价。
技术介绍
蜂蜜是蜜蜂采集蜜源植物的花蜜或蜜露与其分泌物混合，经过一段时间酿制后形成的一类具有甜味食品。蜂蜜作为传统的天然食品，具有美容、养颜、安神等保健功能。蜂蜜的生产劳动强度高、周期长、产量易受到蜜源、天气等因素影响，从而导致蜂蜜的生产成本较高，总产量有限，导致市场上的蜂蜜供不应求。为了追逐巨额利润，不法商贩在蜂蜜的生产、加工、销售等环节，通过掺入蔗糖、转化糖、果糖、葡萄糖、果葡糖浆等制造掺假蜂蜜，严重扰乱了蜂蜜的正常生产及销售秩序，侵害了消费者权益。因此加强对蜂蜜真伪鉴别技术的研究是目前亟需开展的工作。意蜂，来源于意大利，与中蜂之间无法杂交繁殖。意蜂相比于中蜂个体大，背部黄，但是适应性差，易发病。意蜂蜜及中蜂蜜中同样含有α-葡萄糖苷酶，但在这两种蜂蜜中α-葡萄糖苷酶的氨基酸序列不同。α-葡萄糖苷酶是糖苷水解酶大家族中的一类酶，主要功能为水解葡萄糖苷键，释放出葡萄糖作为产物，是生物体糖代谢途径中不可或缺的一类酶。葡萄糖苷键的成键方式分为α-型与β-型两种，意蜂蜜中所含有的葡萄糖苷酶为α-葡萄糖苷酶。液相色谱串联质谱技术由于其高选择性和高灵敏度，非常适用于复杂生物基质中蛋白质的准确表征、鉴定和定量。通过高分辨质谱的蛋白质定量可以通过将蛋白样品用胰蛋白酶消化后检测整个蛋白质或特征肽段来实现。肽段水平的检测可以通过分析靶蛋白质的序列特异于的胰蛋白酶特征肽段来满足定性要求，进而可用于定量。该方法的关键点是为靶蛋白和合适的内标肽段选择一种或多种特异性特征肽段。在此策略的基础上，提出本专利技术。
技术实现思路
为了解决现有技术存在的问题，本专利技术提供一种液相色谱串联质谱定量检测意蜂蜜中α-葡萄糖苷酶的方法。该方法可用于生产和商业中对意蜂蜜的质量控制和真实性鉴定。第一方面，本专利技术筛选出可用于液相色谱串联质谱定量检测意蜂蜜中α-葡萄糖苷酶的特征肽段组：特征肽段1：SISNNEQVK，用于定量，特征肽段2：IYTHDIPETYNVVR，用于定性。本专利技术成功筛选出意蜂特征肽段1：SISNNEQVK，特征肽段2：IYTHDIPETYNVVR，其中特征肽段1：SISNNEQVK可以作为定量肽段，特征肽段2：IYTHDIPETYNVVR可以作为定性肽段，两者特异性通过Uniprot数据库进行了验证；本专利技术同时设计特征肽段相对应的稳定同位素内标（IS）肽段，以便在蜂蜜中准确、灵敏地定量α-葡萄糖苷酶。优选地，所述稳定同位素内标肽段为：SISNNEQVK*，其中，K*表示赖氨酸中的碳置换为13C，氮置换为15N。进一步，所述特征肽段在质谱中所产生的检测信号的母离子具有509.76182质荷比；包含质荷比为713.36824、818.40027的子离子。所述稳定同位素内标肽段在质谱中产生的检测信号的母离子为m/z:513.76642，同时包含质荷比为1088.52023、858.45036的子离子。第二方面，本专利技术提供一种液相色谱串联质谱定量检测意蜂蜜中α-葡萄糖苷酶的方法，包括：通过液相色谱串联质谱法检测待测蜂蜜中α-葡萄糖苷酶的特征肽段，所述特征肽段包括肽段:特征肽段1：SISNNEQVK，用于定量，特征肽段2：IYTHDIPETYNVVR，用于定性。进一步地，在检测之前用检测试剂盒处理所述待测蜂蜜，所述检测试剂盒由以下成分组成:（1）提取缓冲液0.01m/LPBS，pH7.4；（2）胰蛋白酶20ng/μL，溶剂为40mM碳酸氢氨；（3）特征肽段1、2的标准品。具体地，所述方法具体步骤如下：A、配制含有固定浓度的稳定同位素内标肽段的不同浓度的特征肽段标准品溶液，进入液相色谱串联质谱检测并绘制标准曲线；B、提取所述待测蜂蜜中的蛋白质，用胰蛋白酶进行酶切，对酶解产物除盐后作为待测样本；C、向所述待测样本中添加所述稳定同位素内标肽段使其浓度与步骤A中的浓度相同，采用步骤A中相同方法进行液相色谱串联质谱检测；D、对照步骤A所得标准曲线，获得所述待测样本中特征肽段的浓度，从而实现对α-葡萄糖苷酶的定量检测。进一步地，步骤A和C中采用UHPLC-QExactiveplus进行液相色谱串联质谱检测。a1、液相色谱条件如下：色谱柱：为C18柱；流动相组成：流动相A为0.1%甲酸水溶液，流动相B为含0.1%甲酸的乙腈；梯度洗脱条件为：0-0.5min，5%的B；0.5-1.0min，5-15%的B；1.0-6.5min，15-40%的B；6.5-7.0min，40-95%的B；7.0-8.5min，95%的B；8.5-8.6min，95-5%B，8.6-10.0min，5%的B；流速：0.30mL/min；进样量：5.0µL；a2、质谱条件如下：离子源参数：鞘气的流速38；辅助气的流速15；挡锥气的流速0；电喷雾电压3.2kV；离子导管的温度275℃；S-lensRFlevel设为60；离子源温度380℃；采集的模式为正离子模式下的FullMS-ddMS2。前述的方法，步骤C得到的标准曲线为Y=0.00982X-0.000624，R2=0.9983，其中，Y为特征肽段/稳定同位素内标肽段的峰面积比，X为特征肽段的浓度；检测范围为10-1000ng/mL，最低检出限为5ng/mL。该方法采用UHPLC-QExactivePlus（超高效液相色谱-四级杆串联高分辨静电轨道阱）检测蜂蜜样本，通过比较其图谱中α-葡萄糖苷酶特征肽段/IS肽段峰面积比，推算α-葡萄糖苷酶含量，进而判定蜂蜜是否掺假，主要基于α-葡萄糖苷酶的特征肽段的母离子在液质上的峰面积和稳定同位素内标肽段的在液质上的峰面积。应当理解的是，对上述所用试剂或原料的用量进行等比例扩大或者缩小后的技术方案，与上述内容实质等同，均属于本专利技术保护范围。本专利技术采用UHPLC-QExactiveplus仪器对蜂蜜中的α-葡萄糖苷酶定量，基于高分辨质谱提供的精确质量数，该方法具有较高的特异性和灵敏度。基于本方法采用的仪器和参数，不同分析实验室和检测机构可以依据液相串联高分辨质谱技术的相关知识，对其中的参数进行一定调整，上述调整均属于本专利技术保护范围。借由上述技术方案，本专利技术至少具有下列优点及有益效果：鉴于意蜂蜜中α-葡萄糖苷酶的含量相对恒定，本专利技术据此建立起一套蜂蜜真实性评价的方法，用于辅助蜂蜜掺假的鉴别。本专利技术提供的意蜂蜜中α-葡萄糖苷酶蛋白含量的检测方法，具有特异性强、灵敏度高、准确度和精确度好等优点，适用于意蜂α-葡萄糖苷酶的准确定量。该方法对于维护蜂蜜消费行业健康发展和蜂蜜消费者的权益意义重大。附图说明图1为本专利技术实施例1提供的通过UHPLC本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种液相色谱串联质谱定量检测意蜂蜜中α-葡萄糖苷酶的方法，其特征在于，包括：通过液相色谱串联质谱法检测待测蜂蜜中α-葡萄糖苷酶的特征肽段，所述特征肽段包括肽段:/n特征肽段1：SISNNEQVK，用于定量，/n特征肽段2：IYTHDIPETYNVVR，用于定性。/n

【技术特征摘要】
1.一种液相色谱串联质谱定量检测意蜂蜜中α-葡萄糖苷酶的方法，其特征在于，包括：通过液相色谱串联质谱法检测待测蜂蜜中α-葡萄糖苷酶的特征肽段，所述特征肽段包括肽段:
特征肽段1：SISNNEQVK，用于定量，
特征肽段2：IYTHDIPETYNVVR，用于定性。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在检测之前用检测试剂盒处理所述待测蜂蜜，所述检测试剂盒由以下成分组成:
（1）提取缓冲液0.01m/LPBS，pH7.4；
（2）胰蛋白酶20ng/μL，溶剂为40mM碳酸氢氨；
（3）特征肽段1、2的标准品。


3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述方法具体包括以下步骤：
A、配制含有固定浓度的稳定同位素内标肽段的不同浓度的特征肽段标准品溶液，进入液相色谱串联质谱检测并绘制标准曲线；
B、提取所述待测蜂蜜中的蛋白质，用胰蛋白酶进行酶切，对酶解产物除盐后作为待测样本；
C、向所述待测样本中添加所述稳定同位素内标肽段使其浓度与步骤A中的浓度相同，采用步骤A中相同方法进行液相色谱串联质谱检测；
D、对照步骤A所得标准曲线，获得所述待测样本中特征...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨术鹏，李熠，丛晓蕾，周金慧，张金震，金钥，黄京平，杨宇辉，袁媛，赵文，
申请(专利权)人：中国农业科学院蜜蜂研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11