一种基于核酸适配体检测食品毒素的方法技术

本发明专利技术公开了一种基于核酸适配体检测食品毒素的方法，包括以下步骤：1)将带凹槽的玻片进行清洗后，对玻片表面进行氨基硅烷化、醛基化修饰；2)将捕获探针capture DNA固定到醛基化玻片上；3)加入NPS‑aptamer，滴加10.0μL 3×SSC缓冲液，将其放入振荡培养箱中30‑45℃杂交25‑40min；4)在玻璃凹槽中加入食品毒素溶液，45℃反应20min；5)将反应液转移至PCR管，加入H

A method for detection of food toxins based on aptamers

【技术实现步骤摘要】
一种基于核酸适配体检测食品毒素的方法
本专利技术涉及食品毒素检测领域，具体涉及一种基于核酸适配体检测食品毒素的方法。
技术介绍
随着现代检测技术的快速发展，重金属、真菌毒素、残留农药、药物和个人护理品(PhrmaceuticalsandPersonalCareProducts,PPCPs)等环境污染物，在地表水、地下水、土壤、水生生物体、饮用水中不断被检出，直接或间接地对人类的健康造成危害。由于实际环境样品基质复杂，环境污染物检测方法须高效、灵敏和选择性好。基于核酸适配体技术的检测方法相比其他方法具有很强的竞争力。传统的测定方法主要包括色谱分析(薄层色谱分析法，质谱、紫外等联用的高效液相色谱法，气相色谱法等)和酶联免疫吸附测定方法，这两种方法对操作人员的要求比较高，样品处理繁琐，且仪器昂贵，特别在低浓度的时候准确度还不够高。因此，在过去的十几年里，分子水平的生物传感器的研究被大量的报道。各类环境污染物的测定从检测限、准确度、简单操作等方面都有了很大的提高，但是离实际应用还距离很远，还需要投入大量的研究。目前，科研工作者研究重点主要集中在传感器受体的选择、信号传导策略、新材料应用、信号产生机制等方面的研究，以期得到灵敏度高、线性范围宽、使用寿命长、小型便捷的，可以推广应用的传感体系。核酸适配体(aptamer)技术由美国Gold和Szostak两个研究组最早提出，其在生物传感应用领域具有靶分子范围广、亲和力强、制备和修饰方便、快速、稳定性好等优势。aptamer的这些优势使其成为生物传感器的理想识别分子。aptamer是一段与靶物质具有高亲和力和高特异性的寡核苷酸链。核酸适配体法不同于抗原-抗体的特异性反应，可以克服免疫分析易受到pH值、温度等干扰问题，基于aptamer的生物传感器的构建与应用已经成为生物分析领域的研究热点之一。目前，大部分传感器都是基于荧光检测和电化学检测传感系统，需要借助昂贵的仪器和繁琐的操作。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种基于核酸适配体检测食品毒素的方法，以解决现有技术中存在的基于aptamer的生物传感器大部分都是基于荧光检测和电化学检测传感系统，需要借助昂贵的仪器和繁琐的操作的问题。为了实现上述专利技术目的，本专利技术采用的技术方案为：一种基于核酸适配体检测食品毒素的方法，包括以下步骤：1)将带凹槽的玻片进行清洗后，对玻片表面进行氨基硅烷化、醛基化修饰；2)将捕获探针captureDNA固定到醛基化玻片上；将captureDNA用蒸馏水稀释到5.0g/mL，滴加到醛基化玻片表面，室温静置过夜，然后用质量百分浓度为0.2％的SDS清洗，蒸馏水清洗，室温晾干；3)加入NPS-aptamer，滴加10.0μL3×SSC缓冲液来维持湿度，将其放入振荡培养箱中30-45℃杂交25-40min，用配制好的杂交后清洗液1、清洗液2和清洗液3清洗；4)在玻璃凹槽中加入食品毒素溶液，45℃反应20min；5)将反应液转移至PCR管，加入H2O2和TMB溶液，808nm波长的光照10s-25min，温度计测定溶液温度变化；6)建立温度的变化和食品毒素加入量的拟合曲线图，实现食品毒素的测定。进一步的，步骤3)中，杂交温度为45℃，杂交时间为25min。进一步的，步骤3)中，清洗液1为1×SSC+0.03％SDS；清洗液2为0.20×SSC；清洗液3为0.05×SSC。进一步的，步骤5)中，H2O2的摩尔浓度为1.0M，TMB的摩尔浓度为0.4mM。进一步的，步骤5)中，光照辐射度为5.26W·cm-2，光照时间为20min。进一步的，捕获探针captureDNA与NPS-aptamer的体积比为3-6:1。优选，捕获探针captureDNA与NPS-aptamer的体积比为4:1。进一步的，NPS的粒径为100nm-1μm。优选，NPS的粒径为1μm。进一步的，NPS-aptamer是由生物素标记的aptamer和链霉亲和素-NPS结合而成，aptamer核酸适配体序列为5'-GATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGGAGCATCGGACA-3'；捕获探针captureDNA序列为5'-TTTTTTTTTCCGATGCTCCCT-3'，且在5'端修饰了氨基。有益效果：与现有技术相比，本专利技术具有如下优点：(1)测定过程步骤简单、快速；(2)无需使用昂贵的光学仪器，一般温度计读取温度信号即可；(3)灵敏度高，可以最低检测OTA浓度已经达到nm级别。附图说明图1是OTA浓度与温度变化之间的拟合曲线图。具体实施方式下面结合具体实施例进一步说明本专利技术，但这些实施例并不用来限制本专利技术。实施例1一种基于核酸适配体检测食品毒素的方法，包括以下步骤：(1)将带凹槽的普通玻璃浸入铬酸溶液中浸泡过夜，蒸馏水洗；浸入25％(质量百分浓度)氨水中过夜，二次蒸馏水水洗；浸入2％(质量百分浓度)的氨基硅烷95％乙醇溶液中，用冰醋酸调节pH至4.5，室温作用30min，用乙醇超声清洗，用二次蒸馏水超声清洗，室温晾干；室温下含2.5％(质量百分浓度)戊二醛的0.10mol·L-1，pH＝7.2的PBS溶液与氨基玻片作用2h，PBS冲洗，再用二次蒸馏水水洗，晾干。(2)将捕获探针captureDNA(捕获探针captureDNA序列为5'-TTTTTTTTTCCGATGCTCCCT-3'，且在5'端修饰了氨基)固定到醛基化玻片上。将captureDNA用二次蒸馏水稀释到5.0g·mL-1，将样品滴加到醛基化玻片表面，室温静置过夜，然后用0.2％(质量百分浓度)的SDS洗2次，蒸馏水洗两次，室温晾干。(3)加入一定量的NPS-aptamer(NPS-aptamer是由生物素标记的aptamer和链霉亲和素-NPS结合而成，aptamer核酸适配体序列为5'-GATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGGAGCATCGGACA-3')，滴加10.0μL3×SSC来维持湿度，将其放入振荡培养箱中30-45℃杂交25-40min。用配制好的杂交后清洗液1(1×SSC+0.03％SDS)、清洗液2(0.20×SSC)和清洗液3(0.05×SSC)洗液清洗。(4)在玻璃凹槽中加入OTA溶液，45℃反应20min。(5)将反应液转移至PCR管，加入H2O2和TMB溶液(H2O2的摩尔浓度为1.0M，TMB的摩尔浓度为0.4mM)。溶液变成蓝色，用808nm波长的光照射10s-25min，光照辐射度为5.26W·cm-2，温度计测溶液温度变化。(6)建立温度的变化和食品毒素加入量的拟合曲线图，实现食品毒素的测定。步骤(3)中，清洗液由20×SSC与10％SDS按照一定比例配制，具体配置如表1所示。20×SSC含3M氯化钠和0.3M柠檬酸钠，pH为7.0，10％S本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于核酸适配体检测食品毒素的方法，其特征在于，包括以下步骤：/n1)将带凹槽的玻片进行清洗后，对玻片表面进行氨基硅烷化、醛基化修饰；/n2)将捕获探针capture DNA固定到醛基化玻片上；将capture DNA用蒸馏水稀释到5.0g/mL，滴加到醛基化玻片表面，室温静置过夜，然后用质量百分浓度为0.2％的SDS清洗，蒸馏水清洗，室温晾干；/n3)加入NPS-aptamer，滴加10.0μL 3×SSC缓冲液维持湿度，将其放入振荡培养箱中30-45℃杂交25-40min；用配制好的杂交后清洗液1、清洗液2和清洗液3清洗；/n4)在玻璃凹槽中加入食品毒素溶液，45℃反应20min；/n5)将反应液转移至PCR管，加入H

【技术特征摘要】
1.一种基于核酸适配体检测食品毒素的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将带凹槽的玻片进行清洗后，对玻片表面进行氨基硅烷化、醛基化修饰；
2)将捕获探针captureDNA固定到醛基化玻片上；将captureDNA用蒸馏水稀释到5.0g/mL，滴加到醛基化玻片表面，室温静置过夜，然后用质量百分浓度为0.2％的SDS清洗，蒸馏水清洗，室温晾干；
3)加入NPS-aptamer，滴加10.0μL3×SSC缓冲液维持湿度，将其放入振荡培养箱中30-45℃杂交25-40min；用配制好的杂交后清洗液1、清洗液2和清洗液3清洗；
4)在玻璃凹槽中加入食品毒素溶液，45℃反应20min；
5)将反应液转移至PCR管，加入H2O2和TMB溶液，808nm波长的光照10s-25min，温度计测定溶液温度变化；
6)建立温度的变化和食品毒素加入量的拟合曲线图，实现食品毒素的测定。


2.根据权利要求1所述的基于核酸适配体检测食品毒素的方法，其特征在于，步骤3)中，所述杂交温度为45℃，杂交时间为25min。


3.根据权利要求1所述的基于核酸适配体检测食品毒素的方法，其特征在于，步骤3)中，所述清洗液1为1×SSC+0.03％SDS；所述清洗液2为0.20×SSC；所述清洗液3为0.05×SSC。


4.根据权利要求1所述的基于核酸适配体检测食品毒素的方法，其特征在于，...

【专利技术属性】
技术研发人员：秦品珠，孔金明，李海云，潘俊晶，孙婉铭，周旋，
申请(专利权)人：江苏开放大学江苏城市职业学院，
类型：发明
国别省市：江苏;32