本文提供了涉及检测分析物的技术，和特别但非排他地涉及使用基于检测探针的瞬时结合的技术检测分析物例如核酸、蛋白、小分子和其它分子的方法、系统、组合物和试剂盒的技术。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】分析物检测本申请要求2017年3月8日提交的美国临时专利申请系列号62/468,578的优先权，所述临时专利申请通过引用以其整体结合到本文中。关于联邦资助研究或开发的声明本专利技术在美国国立卫生研究院授予的资助GM062357下和在美国海军海军研究办公室授予的资助W911NF-12-1-0420下在政府支持下完成。政府具有本专利技术的某些权利。领域本文提供了涉及检测分析物的技术，和特别但非排他地涉及使用基于检测探针的瞬时结合的技术检测分析物例如核酸、蛋白、小分子和其它分子的方法、系统、组合物和试剂盒。背景检测和定量复杂的混合物中的低浓度分析物在生物学研究和临床诊断中具有许多应用。许多重要的生物学分析物是疾病和其它生物学状态的生物标志物。例如，在血液、尿、唾液和其它体液中少部分的携带致癌突变的循环核酸的检测与某些类型的癌症的发生率相关。此外，蛋白分析物例如前列腺特异性抗原(PSA)和白介素也具有当前或潜在的临床和研究意义。小分子代谢物的水平提供了在生物学系统中关于健康和药物处理的信息。在分子诊断和研究中抗体、适体、核酸和其它亲和试剂广泛用于这些测定。低丰度分子分析物的检测中的挑战是灵敏度和特异性之间的权衡。即，随着测定的灵敏度增加，假阳性的可能性增加，这降低了特异性。例如，普通ELISA(酶联免疫吸附测定)方法中的假阳性起因于第一或第二抗体与测定表面的非特异性结合，因此当预期的靶分析物不存在时产生信号。在这样的情况下，改进检测器灵敏度或信号放大效率增加真阳性和假阳性检测事件二者，导致更低的特异性。尽管已开发策略来降低假阳性事件，包括用封闭溶液孵育表面、严格性洗涤方案和使用必须共同结合靶分析物以产生信号的分裂探针，然而当前方法遭受到假阳性，因为在实践中假阳性信号不能完全被消除。结果是，对于许多类型的生物标志物，在单分子水平上以高特异性检测靶分析物仍然是困难的。简述之前已经描述了使用查询探针的瞬时结合的强度对比时间数据的动力学建模和分析检测核酸的策略(参见Johnson-Buck等(2015)Nat.Biotechnol.33:730-32;美国专利申请公开号20160046988;国际专利申请号PCT/US2017/016977，其各自通过引用以其整体结合到本文中)。相比之下，本专利技术的技术在一些实施方案中提供一种通过确定低亲和力查询探针的每个结合和解离事件的空间和时间坐标，然后按位置簇集结合事件，和使每个簇事件经历动力学分析(例如，确定每单位时间每个靶分子的事件数量或事件之间停留时间的平均数、中值、最大值、最小值、标准偏差或其它度量)，检测与表面稳定结合的靶分析物的新方法。该方法允许区别非特异性探针结合和探针与靶分析物的结合，这是因为在查询探针与单个靶分析物的多个结合事件上的位置对比时间统计学累积得到在分析物的身份方面比任何以下各项更大的置信度：单一结合事件、跨越观察区域的结合事件的累积计数或跨越观察区域的探针信号的累积计数。此外，该方法使用基于强度波动(而不是总体信号强度)的空间位置信息和簇集来超越检测装置的分辨率极限，以提供“超分辨率”测量。因此，在一些实施方案中该技术提供比之前公开的方法更高的动态范围(图2)，和检测探针与靶分析物的特异性结合和检测探针与成像表面或其它表面结合分析物的非特异性结合的区别力的改进(图3)。特别地，来自靶标结合的信号的紧密簇集的空间定位和探针与靶标结合的独特动力学行为用于提供靶标信号与非特异性(例如，假阳性)信号的区别力的改进。在一些实施方案中，当应用于大的检测器区域上的查询探针结合事件时，该方法可用于在单分子水平上数字计数一种或多种靶分析物。该技术提供超过现有技术的优点，包括但不限于，改进分析物相对于背景结合的区别力；改进密切相关的分析物之间的区别力；和极度稀释或低体积样本的分析(例如，相对于分析相同分析物的现有技术，灵敏度和/或特异性改进)。因此，在一些实施方案中，该技术提供一种表征样品中的分析物的方法。在检测的分析物方面，该技术不受限制。例如，实施方案提供分析物的检测，所述分析物是核酸、多肽、碳水化合物、多糖、脂肪酸、磷脂、糖脂、鞘脂、小分子、代谢物、辅因子等。在一些实施方案中，查询和/或捕获探针是核酸、多肽(例如，抗体、抗体片段、线性抗体、单链抗体或其它抗原-结合抗体衍生物；酶；特异性识别分析物的结合蛋白)；在其中分析物包含碳水化合物或多糖的一些实施方案中，查询探针包含碳水化合物-结合蛋白，例如凝集素或碳水化合物-结合抗体。在一些实施方案中，在碳水化合物单体之间特定的糖苷键或糖苷键组的存在产生查询探针结合的可区别模式。在一些实施方案中，捕获探针是兔单克隆抗体；和在一些实施方案中，查询探针是小鼠单克隆抗体。例如，在一些实施方案中该方法包括作为表面上(x,y)位置的函数，记录固定至表面的分析物的查询探针事件的时间依赖性信号；按(x,y)位置将事件簇集至局部簇；和计算每个事件簇的动力学参数以表征所述分析物。在一些实施方案中，表面是固体支持物。在一些实施方案中，表面是可扩散的。在一些实施方案中，记录查询探针事件的时间依赖性信号包括以单分子灵敏度测量分析物的信号。在一些实施方案中，方法进一步包括计算差示强度图，其包含表面处作为(x,y)位置的函数的时间依赖性信号强度变化。在一些实施方案中，(x,y)位置以亚像素准确度确定。在一些实施方案中，簇集的事件代表单分析物分子的结合事件。在一些实施方案中，表征分析物包含指示样品中分析物的存在、不存在、浓度或数量。在一些实施方案中，分析物包含多肽。在一些实施方案中，该方法指示多肽上翻译后修饰的存在或不存在。在一些实施方案中，翻译后修饰介导查询探针与多肽的瞬时缔合。在一些实施方案中，化学亲和标签介导翻译后修饰和查询探针之间的瞬时缔合。在一些实施方案中，化学亲和标签是核酸。在一些实施方案中，分析物是核酸。在一些实施方案中，查询探针与分析物的瞬时缔合通过分析物的共价修饰而可区别地受到影响。在一些实施方案中，查询探针是核酸或适体。在一些实施方案中，查询探针是低亲和力抗体、抗体片段或纳米抗体。在一些实施方案中，查询探针是DNA-结合蛋白、RNA-结合蛋白或DNA-结合核糖核蛋白复合物。在一些实施方案中，每个查询探针事件的(x,y)位置通过使用形心确定、最小二乘拟合至高斯函数、最小二乘拟合至艾里斑函数、最小二乘拟合至多项式函数(例如，抛物线)或最大似然估计处理差示强度分布图来确定。在一些实施方案中，在表面固定之前分析物在载体的存在下经历热变性。在一些实施方案中，在表面固定之前分析物在载体的存在下经历化学变性，例如，分析物用变性剂例如尿素、甲酰胺、盐酸胍、高离子强度、低离子强度、高pH、低pH或十二烷基硫酸钠(SDS)变性。进一步的实施方案提供一种用于定量样品中的分析物的系统。例如，在一些实施方案中，系统包含将分析物稳定固定至表面的功能性；以低亲和力结合靶分析物的自由扩散性查询探针；和记录分析物的查询探针事件和查询探针事件的空间位置的检测系统。在一些实施方案中，系统进一步包含根据所述靶分析物的重复结合本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种表征样品中的分析物的方法，所述方法包括：/n(a) 作为表面上(x, y)位置的函数，记录固定至表面的分析物的查询探针事件的时间依赖性信号；/n(b) 按(x, y)位置将事件簇集成局部簇；和/n(c) 计算每个事件簇的动力学参数以表征所述分析物。/n
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170308 US 62/4685781.一种表征样品中的分析物的方法，所述方法包括：
(a)作为表面上(x,y)位置的函数，记录固定至表面的分析物的查询探针事件的时间依赖性信号；
(b)按(x,y)位置将事件簇集成局部簇；和
(c)计算每个事件簇的动力学参数以表征所述分析物。
2.权利要求1的方法，其中所述表面为固体支持物。
3.权利要求1的方法，其中所述表面为可扩散的。
4.权利要求1的方法，其中记录查询探针事件的时间依赖性信号包括以单分子灵敏度测量分析物的信号。
5.权利要求1的方法，其进一步包括计算差示强度图，所述差示强度图包含表面处作为(x,y)位置的函数的时间依赖性信号强度变化。
6.权利要求1的方法，其中(x,y)位置以亚像素准确度确定。
7.权利要求1的方法，其中簇集的事件代表单分析物分子的结合事件。
8.权利要求1的方法，其中表征所述分析物包括指示样品中分析物的存在、不存在、浓度或数量。
9.权利要求1的方法，其中所述分析物包含多肽。
10.权利要求9的方法，其中所述方法指示多肽上翻译后修饰的存在或不存在。
11.权利要求10的方法，其中所述翻译后修饰介导查询探针与多肽的瞬时缔合。
12.权利要求10的方法，其中化学亲和标签介导翻译后修饰和查询探针之间的瞬时缔合。
13.权利要求12的方法，其中所述化学亲和标签是核酸。
14.权利要求1的方法，其中所述分析物是核酸。
15.权利要求1的方法，其中查询探针与分析物的瞬时缔合可区别地受分析物的共价修饰的影响。
16.权利要求1的方法，其中所述查询探针是核酸或适体。
17.权利要求1的方法...
【专利技术属性】
技术研发人员：AE约翰逊巴克，N沃尔特，M特瓦里，
申请(专利权)人：密歇根大学董事会，
类型：发明
国别省市：美国;US
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