一种海洋发光细菌冻干制剂及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种海洋发光细菌冻干制剂及其制备方法，属于微生物冻干制剂范畴。该冻干制剂包含菌泥和冻干保护剂，且经菌液制备、菌泥制备、混合、预冻和冻干等步骤制备而成。使用该保护剂制得的海洋发光细菌冻干粉中，于2~8℃下保存18个月后，菌种恢复发光率及菌种发光性能均维持稳定，能极大提高海洋发光细菌菌种的保存效果和质量，便于环境毒性检测中对菌种的使用。

A lyophilized preparation of Marine luminous bacteria and its preparation method

【技术实现步骤摘要】
一种海洋发光细菌冻干制剂及其制备方法
本专利技术设计一种专门针对海洋发光细菌冻干制剂及其制备方法，属于微生物冻干制剂范畴。
技术介绍
随着我国工农业的高速发展，各种生态环境污染问题严峻，对生态环境和人体健康带来很大威胁。目前，生物毒性检测实验主要有鱼类急、慢性、蚤类毒性、藻类毒性及微生物毒性实验（如发光细菌对污染物毒性的发光抑制）等。而基于发光细菌为指示物的生物毒性检测法已广泛应用于农药残留、重金属毒性与生物毒素等方面的检测。发光细菌在外界毒物干扰下发光生理过程会受到干扰，从而引起发光强度的变化，且发光值降低程度与外界毒性物质的在一定程度里面呈比例关系，从而通过发光亮度变化反应环境毒性强弱。发光细菌法因其检测速度快、简便、灵敏程可靠、成本低等特点而备受关注。发光细菌用于环境毒性检测过程中，菌种是重要的影响因素。目前，市场上常用的发光细菌菌种包括两类海水细菌（明亮发光杆菌和费氏弧菌）和一类淡水细菌（青海弧菌）。其中以明亮发光杆菌在《水质急性毒性的测定发光细菌法》（GB/T15441-1995）中所使用；费氏弧菌在欧盟的标准中所使用。目前，用于毒性检测的发光细菌较多为鲜活细菌，无法长期保存，而菌种制成冻干制品后可以长期保存，从而简化使用发光细菌法的前期工作。冻干制品直接由冰晶升华而制成，具有多孔结构，既能使细菌保持原有活性，又不会破环细胞的形态以及特性。冷冻干燥是将细菌悬浮液冷冻到冰点以下，从而转变为固体结晶态，然后在低温低压(真空)下使固体升华而脱水的干燥方法。干燥处理过程会破坏微生物的细胞膜，引起细胞的大量死亡，通过添加低温保护剂，能够使细菌悬浮，减少活菌在冻干过程中的死亡。因此，在冻干前加入的保护剂配方就成为了至关重要的决定性因素，它既会影响到储存期细胞的活性以及稳定性，也会影响到复水时细胞存活率。因此，为提高冷冻干燥后菌种的存活率、恢复发光率以及长时间保存的稳定性，研制一种配方简单、安全性好、效果好的发光细菌冻干制剂有积极的实用价值。
技术实现思路
为解决上述技术问题，本专利技术的目的是提供一种海洋发光细菌冻干制剂的配方及制备方法。本专利技术令人惊奇地发现，使用本专利技术的冻干保护剂，且在加入特定分子量的壳聚糖混合制成冻干制品后，制剂不仅外观、复溶性、结构强度等性质优良，且显著提高冷冻干燥后菌种的存活率、恢复发光率以及长时间保存的稳定性。本专利技术基于上述发现而得以完成。为了实现以上目的，本专利技术采用的技术方案是：本专利技术的一种冻干制剂的制备包括以下步骤：（1）菌液制备：将菌种接种于斜面，20℃恒温培养24~48h，反复活化2~3次。取活化好的纯菌种以1%接种量接种于100mL液体培养基中扩大培养，20℃恒温，140~160rpm/min震荡10~17小时，通过OD600nm判断菌液浓度，控制菌液浓度初始OD600为0.8~1.0，获得的新鲜菌液备用；（2）菌泥制备：分装菌液，离心，弃去上清液后获得菌泥；（3）冻干保护剂的制备：冻干保护剂由以下原料组成：脱脂乳的含量为15wt%，蔗糖的含量为6wt%，壳聚糖的含量为0.6wt%，谷氨酸钠的含量为1wt%，四氢嘧啶的含量为0.4wt%，余量为蒸馏水。其制备方法包括以下步骤：a配液：以蒸馏水分别溶解脱脂乳、蔗糖、壳聚糖、谷氨酸钠和四氢嘧啶，配制成各原料的母液，且母液浓度配制成5倍于配方量的浓度；b灭菌：脱脂乳母液、蔗糖母液在115℃下高温高压灭菌15min，快速冷却后，4℃冷藏待用；壳聚糖母液、四氢嘧啶母液以0.22μm无菌微孔过滤器进行除菌；谷氨酸钠母液于121℃下高温高压灭菌21min，快速冷却后，4℃冷藏待用;c混合：各母液经灭菌后，按1：1：1：1：1混合均匀即得保护剂；（4）菌泥与冻干保护剂混合：将所述菌泥加入冻干保护剂混合，充分震荡混匀；（5）预冻：将混合后的菌悬液移入西林瓶，1~2h内迅速降温至-40℃~-70℃，料液变为块状结构，预冻24~48h；（6）冻干：将（5）中预冻西林瓶真空冷冻干燥后即得；所述步骤（1）中培养基配方为：甘油0.3%、氯化钠3%、磷酸氢二钠0.5%、胰蛋白胨0.5%、磷酸二氢钾0.1%、酵母膏0.5%。所述步骤（1）的菌种为明亮发光杆菌、费氏弧菌中的一种或多种；所述步骤（2）中离心转速为6000~10000g/min，离心时间为5-10分钟；所述步骤（4）中菌泥与保护剂混合按照菌泥离心前体积与保护剂体积1：1进行混合；所述步骤（6）中，真空度0~1.0Pa，温度-40℃，持续冻干60~72h。所述的脱脂乳的脂肪含量≤2.0%，且蛋白质含量≥30%。所述的壳聚糖分子量为100KDa，脱乙酰度为80%。与现有技术相比，本专利技术具有以下突出优点和有益效果：在常规脱脂奶粉和蔗糖保护剂基础上，添加壳聚糖、谷氨酸钠和四氢嘧啶。其中四氢嘧啶来源于高嗜盐菌，可有效保护海洋细菌在极端条件下受到损伤。壳聚糖在高寒、干燥失水等恶劣的条件下，特定分子量的壳聚糖与其他组成成分既能产生良好的相容性，也能够在细胞表面形成特殊的保护膜，充分有效地保护生物分子结构免受破坏，从而维持菌种的生物特征，能够有效提高菌种在冷冻干燥过程中的抗冷冻抗干燥能力。谷氨酸钠能够升高冻干制品的塌陷温度，阻止因塌陷引起蛋白质结构的破坏。经保护剂与菌泥按特定比例混合制成冻干制品后，所得冻干制剂不仅外观优良，复溶性好，制剂强度好，且菌种长期稳定存活。本专利技术中一种海洋发光细菌冻干制剂制备工艺简单、操作简便，适于规模化工业生产及应用。与发光细菌混合后冻干，不仅提升细菌的存活率，且于2~8℃下保存18个月后，菌种恢复发光率及菌种发光性能均维持稳定，能极大提高海洋发光细菌菌种的保存效果和质量。具体实施方式为了使本专利技术更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述。应理解这些实施例仅用于说明本专利技术而不限制专利技术的范围。实施例1冻干粉的制备：（1）菌液制备：将明亮发光杆菌菌种接种于斜面，20℃恒温培养24~48h，反复活化3次；取活化好的纯菌种以1%接种量接种于100mL液体培养基中扩大培养，20℃恒温，150rpm/min震荡15个小时，其中，培养基配方为：甘油0.3%、氯化钠3%、磷酸氢二钠0.5%、胰蛋白胨0.5%、磷酸二氢钾0.1%、酵母膏0.5%。通过OD600nm判断菌液浓度，控制菌液浓度初始OD600为0.8~1.0，获得的新鲜菌液备用；（2）菌泥制备：分装菌液，离心，转速为6000g/min，离心时间为10分钟，弃去上清液后获得菌泥；（3）冻干保护剂的制备：冻干保护剂由以下原料组成：脱脂乳（脂肪含量≤2.0%，且蛋白质含量≥30%）的含量为15wt%，蔗糖的含量为6wt%，壳聚糖的含量为0.6wt%（分子量为100KDa，脱乙酰度为80%），谷氨酸钠的含量为1wt%，四氢嘧啶的含量为0.4wt%，余量为蒸馏水。其制备方法包括以下步骤：a配液：以蒸馏水分别溶解本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种海洋发光细菌冻干制剂，其特征在于：包括以下步骤：/n（1）菌液制备：将菌种接种于斜面，20℃恒温培养24~48h，反复活化2~3次；取活化好的纯菌种以1%接种量接种于100mL液体培养基中扩大培养，20℃恒温，140~160rpm/min震荡10~17小时，通过OD

【技术特征摘要】
1.一种海洋发光细菌冻干制剂，其特征在于：包括以下步骤：
（1）菌液制备：将菌种接种于斜面，20℃恒温培养24~48h，反复活化2~3次；取活化好的纯菌种以1%接种量接种于100mL液体培养基中扩大培养，20℃恒温，140~160rpm/min震荡10~17小时，通过OD600nm判断菌液浓度，控制菌液浓度初始OD600为0.8~1.0，获得的新鲜菌液备用；
（2）菌泥制备：分装菌液，离心，弃去上清液后获得菌泥；
（3）冻干保护剂的制备：冻干保护剂由以下原料组成：脱脂乳的含量为15wt%，蔗糖的含量为6wt%，壳聚糖的含量为0.6wt%，谷氨酸钠的含量为1wt%，四氢嘧啶的含量为0.4wt%，余量为蒸馏水；
其制备方法包括以下步骤：
a配液：以蒸馏水分别溶解脱脂乳、蔗糖、壳聚糖、谷氨酸钠和四氢嘧啶，配制成各原料的母液，且母液浓度配制成5倍于配方量的浓度；
b灭菌：脱脂乳母液、蔗糖母液在115℃下高温高压灭菌15min，快速冷却后，4℃冷藏待用；壳聚糖母液、四氢嘧啶母液以0.22μm无菌微孔过滤器进行除菌；谷氨酸钠母液于121℃下高温高压灭菌21min，快速冷却后，4℃冷藏待用；
c混...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨毅红，何怀文，
申请(专利权)人：电子科技大学中山学院，
类型：发明
国别省市：广东;44