一种长喙壳菌外源基因转化的方法技术

本发明专利技术公开了属于生物技术领域的一种长喙壳菌外源基因转化的方法。本发明专利技术的方法通过将长喙壳菌的原生质体与适量的含有筛选标记的外源DNA片段和含有向导RNA(SgRNA)的质粒载体进行混合，然后利用PEG介导的原生质体的转化及转化子筛选，从而将含有筛选标记的外源DNA片段转入长喙壳菌基因组中，实现了PEG介导的长喙壳菌原生质体转化，建立了一套完整的遗传转化、筛选方法，易获得表达潮霉素抗性蛋白且稳定遗传的转化菌株，转化效率较高。

A method of foreign gene transformation of coracoid

【技术实现步骤摘要】
一种长喙壳菌外源基因转化的方法
本专利技术属于生物
，具体涉及一种长喙壳菌外源基因转化的方法。
技术介绍
长喙壳菌是一种分布广泛且危害严重的病原真菌，可侵染14个属30余种木本及草本植物。在我国已有该菌危害甘薯、石榴、桉树、芋头、枇杷、天南星、芒果等作物的报道。其中在石榴和芒果上引起严重的维管束病害，生产上称之为“癌症病害”。由于目前对该类真菌的研究多集中于传统生物学方面，鲜有其分子机制方面的研究，检索国内外相关文献未见其遗传转化方法相关报道。为了进行长喙壳菌分子生物学方面的研究，建立一个高效的遗传转化体系是必需的，也是深入研究该菌对经济林木及草本植物的致病分子机制以及菌株自身生长发育的前提。因此，建立一种简单、高效、稳定的遗传转化方法对研究石榴枯萎病、芒果枯萎病等该类病害的致病机理具有重要意义。
技术实现思路
为了克服现有技术的缺点，本专利技术的目的是提供一种简单、高效、稳定的长喙壳菌的遗传转化方法。为此，本专利技术的技术方案如下：一种长喙壳菌转化的方法，包括以下步骤：(1)制备长喙壳菌的原生质体悬浮液，然后将原生质体悬浮液、外源DNA片段或其质粒、和表达CRISPR/Cas9-sgRNA质粒混合，加入肝素钠后，静置处理，离心；(2)离心后弃上清液，将沉淀加入培养基中进行再生培养，后转入平板进行生长培养，筛选后，得转化子。上述方法中，所述外源DNA片段包含要敲除的目的基因上、下游800-1200bp，例如包含目的基因上、下游800bp、900bp、1000bp、1100bp或1200bp。上述方法中，所述外源DNA片段还包含筛选或标记基因，例如，潮霉素基因。上述方法中，所述筛选或标记基因可以为双筛选或双标记基因。上述方法中，进一步，所述外源DNA片段还可以包含要插入的外源基因片段。上述方法中，可选的，所述外源DNA片段依次包含要敲除的目的基因上游800-1200bp、筛选或标记基因、或外源基因和要敲除的目的基因下游800-1200bp。上述方法中，所述含有外源DNA片段的质粒，其原始骨架，可选的，为PSK(-)质粒。上述方法中，所述原生质体悬浮液的制备方法包括：用缓冲液重悬原生质体，制备原生质体悬浮液，浓度为(1-10)×107个/mL。上述方法中，所述外源DNA片段或其质粒、表达CRISPR/Cas9-sgRNA质粒加入的量分别为0.1-10μg/100μL。可选的，加入的量分别为0.5-5μg/100μL，或者，加入的量分别为2-5μg/100μL。上述方法中，所述表达CRISPR/Cas9-sgRNA质粒，可选的，其原始质粒为pCRISPR/Cas-U6-1，构建方法参考文章“Tailor-MadeCRISPR/CasSystemforHighlyEfficientTargetedGeneReplacementintheRiceBlastFungus”。其中sgRNA根据目的基因设计和制备。上述方法中，所述静置处理包括：加入肝素钠后，于冰上静置，再加入PTC溶液、静置、用缓冲液重悬。上述方法中，所述PTC溶液为含有PEG4000和氯化钙的25mMTris-HCl溶液，其pH值为7.5，其中PEG4000的含量为60-66％，氯化钙的浓度为50mM；PTC溶液加入量为：与原生质体悬浮液的体积比为25:1-2；所述肝素钠为肝素钠溶液，浓度为5mg/mL，加入量与原生质体悬浮液的体积比为1:20-40。上述方法中，所述缓冲液为STC缓冲液，所述STC缓冲液为含有山梨醇和氯化钙的25mMTris-HCl溶液，其pH值为7.5，其中山梨醇的浓度为1.0M，氯化钙的浓度为50mM。上述方法中，所述再生培养的方法包括：培养基为OCM培养基，室温培养6-8h，所述OCM培养基的组成包括：麦芽提取物5g/L、酵母5g/L、磷酸铵1.32g/L和蔗糖0.6M。上述方法中，所述生长培养的方法包括：涂布于BottomAgar平板，室温培养1-2天后，将未凝固的TopAgar培养基覆盖到BottomAgar平板上，培养至转化子长出。上述方法中，所述Bottomagar平板培养基组成包括：麦芽提取物5g/L、酵母5g/L、磷酸铵1.32g/L、琼脂16g/L和蔗糖0.6M；所述TopAgar平板培养基组成包括：麦芽提取物20g/L、酵母2g/L、琼脂糖10g/L和潮霉素50mg/L。本专利技术的有益效果：本专利技术通过将长喙壳菌的原生质体与适量的含有筛选标记的外源DNA片段和含有向导RNA(SgRNA)的质粒载体进行混合，然后利用PEG介导的原生质体的转化及转化子筛选，从而将含有筛选标记的外源DNA片段转入长喙壳菌基因组中，实现了PEG介导的长喙壳菌原生质体转化，建立了一套完整的遗传转化、筛选方法，易获得表达潮霉素抗性蛋白且稳定遗传的转化菌株，转化效率较高。本专利技术的方法可应用于长喙壳菌的分子生物学研究，如研究该菌对经济林木及草本植物的致病分子机制以及该菌的生长发育等。附图说明图1为长喙壳菌菌株MG-1-7阳性转化子的菌落形态图。图2为长喙壳菌菌株MG-1-7部分转化子的琼脂糖电泳图；图中M：DNAmarker，1：MG-1-7野生型菌株的扩增结果，2-3：潮霉素抗性基因的阳性对照，4-15：MG-1-7菌株部分转化子的扩增结果，N：阴性对照(ddH2O)。具体实施方式下面将结合具体实施例对本专利技术的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例是本专利技术的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。本专利技术中所使用的材料和装置，如无特殊说明，均为市售。以下结合说明书附图和实施例对本专利技术作进一步的说明，但不是限制本专利技术。实施例1长喙壳菌原生质体的转化本实施例中的缓冲液STC为：含有山梨醇和氯化钙的25mMTris-HCl溶液，其pH值为7.5，其中山梨醇的浓度为1.0M，氯化钙的浓度为50mM。本实施例中的PTC溶液为：含有PEG4000和氯化钙的25mMTris-HCl溶液，其pH值为7.5，其中PEG4000的含量为60％，氯化钙的浓度为50mM。本实施例中的OCM培养基的组成为：麦芽提取物5g/L、酵母5g/L、磷酸铵1.32g/L和蔗糖0.6M。本实施例中的Bottomagar平板培养基组成为：麦芽提取物5g/L、酵母5g/L、磷酸铵1.32g/L、琼脂16g/L和蔗糖0.6M。本实施例中的TopAgar平板培养基组成为：麦芽提取物20g/L、酵母2g/L、琼脂糖10g/L和潮霉素50mg/L。一、长喙壳菌原生质体的制备长喙壳菌原生质体可以按中国专利文献CN109161485A中的方法制备，具体方法如下：1)菌株活化培养：将保存的长本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种长喙壳菌转化的方法，其特征在于，包括以下步骤：/n(1)制备长喙壳菌的原生质体悬浮液，然后将原生质体悬浮液、外源DNA片段或其质粒、和表达CRISPR/Cas9-sgRNA质粒混合，加入肝素钠后，静置处理，离心；/n(2)离心后弃上清液，将沉淀加入培养基中进行再生培养，后转入平板进行生长培养，筛选后，得转化子。/n

【技术特征摘要】
1.一种长喙壳菌转化的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)制备长喙壳菌的原生质体悬浮液，然后将原生质体悬浮液、外源DNA片段或其质粒、和表达CRISPR/Cas9-sgRNA质粒混合，加入肝素钠后，静置处理，离心；
(2)离心后弃上清液，将沉淀加入培养基中进行再生培养，后转入平板进行生长培养，筛选后，得转化子。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述外源DNA片段包含要敲除的目的基因上、下游800-1200bp。


3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述外源DNA片段还包含要插入的外源基因片段。


4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述原生质体悬浮液的制备方法包括：用缓冲液重悬原生质体，制备原生质体悬浮液，浓度为(1-10)×107个/mL。


5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述外源DNA片段或其质粒、表达CRISPR/Cas9-sgRNA质粒加入的量分别为终浓度为0.1-10μg/100μL。优选的，为0.5-5μg/100μL，进一步优选为，2-5μg/100μL。


6.根据权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在于，所述静置处理包括：加入肝素钠后，于冰上静置，再加入PTC溶液、静置、用缓冲液重悬。


7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述PTC溶液为含有...

【专利技术属性】
技术研发人员：李健强，张治萍，李迎宾，罗来鑫，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：北京;11