【技术实现步骤摘要】
一种将目的基因多拷贝整合至酿酒酵母基因组的方法
本专利技术涉及微生物领域，具体涉及一种将目的基因多拷贝整合至酿酒酵母基因组的方法。
技术介绍
酿酒酵母系统是最重要的外源基因表达系统之一，已广泛用于生物制剂的合成。酿酒酵母存在高效的同源重组机制，两个DNA分子间只要有30-50bp长的同源区段就可以准确、有效地进行同源重组。根据酿酒酵母较易发生同源重组的特点，使用重复序列作为整合载体同源重组位点是提高外源基因在酵母基因组中拷贝数的有效途径。酵母基因组中rDNA有100-200个重复单元，拷贝数相比于其他位点的拷贝数具有明显的增加，是构建高拷贝整合表达载体同源重组区的首选序列，每个rDNA重复单元长达9.1kb左右，由5SrDNA和35SrDNA基因构成的转录区和由NTS1和NTS2构成的非转录区所组成。CRISPR/Cas9技术是近些年的新技术，因其可广泛并精准编辑生物基因组，一经问世，便成为世界上最炙手可热的焦点之一。CRISPR/Cas技术分为三类，Cas9介导的基因编辑技术属于Ⅱ类，最常用于真核细胞的基因...
【技术保护点】
1.一种将目的基因多拷贝整合至酿酒酵母基因组的方法，包括以下步骤：/n1)将Cas9核酸酶表达载体转化至酿酒酵母中表达；/n2)选择酿酒酵母多拷贝rDNA重复单元NTS2非转录区中的一个或多个靶序列，将所选择靶序列中切割位点两侧的同源臂引物设计至目的基因表达盒的PCR扩增引物的前端，合成同源臂加载引物，扩增一个或多个目的基因表达盒，纯化扩增产物作为供体DNA片段；所述靶序列中切割位点两侧的同源臂引物的序列长度为15-90bp，所述酿酒酵母多拷贝rDNA重复单元NTS2非转录区的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；/n3)选择靶序列对应的转录gRNA的载体，与步骤2)中的...
【技术特征摘要】
1.一种将目的基因多拷贝整合至酿酒酵母基因组的方法，包括以下步骤：
1)将Cas9核酸酶表达载体转化至酿酒酵母中表达；
2)选择酿酒酵母多拷贝rDNA重复单元NTS2非转录区中的一个或多个靶序列，将所选择靶序列中切割位点两侧的同源臂引物设计至目的基因表达盒的PCR扩增引物的前端，合成同源臂加载引物，扩增一个或多个目的基因表达盒，纯化扩增产物作为供体DNA片段；所述靶序列中切割位点两侧的同源臂引物的序列长度为15-90bp，所述酿酒酵母多拷贝rDNA重复单元NTS2非转录区的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；
3)选择靶序列对应的转录gRNA的载体，与步骤2)中的供体DNA片段共转化至步骤1)中表达Cas9核酸酶的酿酒酵母中，筛选转化子；
4)去除筛选出的转化子中在步骤1)和步骤2)导入的载体。
2.根据权利要求1所述将目的基因多拷贝整合至酿酒酵母基因组的方法，其特征在于，步骤2)中的靶序列为所述酿酒酵母的多拷贝rDNA重复单元NTS2非转录区中第239-258bp、第365-384bp、第1019-1038bp和/或第1126-1145bp，依次编号为S1、S2、S3和S4。
3.根据权利要求1所述将目的基因多拷贝整合至酿酒酵母基因组的方法，其特征在于，步骤3)所述转录gRNA的载体为gRNA-rDNA-S1、gRNA-rDNA-S2、gRNA-rDNA-S3或gRNA-rDNA-S4，所包含的向导序列依次与所述酿酒酵母的多拷贝rDNA重复单元NTS2非转录区中的第239-258bp、第365-384bp、第1019-1038bp、第1126-1145bp相同。
4.根据权利要求1所述将目的基因多拷贝整合至酿酒酵母基因组的方法，其特征在于，步骤3)所述转录gRN...
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