一种检测动物性水产干制品中酸性偶氮类着色剂的液质联用检测方法技术

本发明专利技术提供了一种检测动物性水产干制品中9种酸性偶氮类着色剂的液质联用检测方法。动物性水产干制品样品经均质、脱脂和提取，利用聚酰胺固相萃取柱净化，最后用液相色谱‑串联四级杆质谱联用仪进行定量检测。采用C

A method for the determination of acid azo colorants in dried aquatic products by LC-MS

【技术实现步骤摘要】
一种检测动物性水产干制品中酸性偶氮类着色剂的液质联用检测方法
本专利技术属于食品安全检测
，是一种利用液质联用仪测定动物性水产干制品中酸性偶氮类着色剂的方法。
技术介绍
酸性偶氮类着色剂因为分子结构中含有偶氮结构、磺酸基团和酚羟基，亲水性强，着色效果好，在食品加工和工业生产中应用广泛。本研究选取的9种红黄色着色剂中，酸性大红GR是非食用物质，目前尚未有国家规定的标准检测方法，酸性橙Ⅱ是卫生部规定的非食用物质，其余7种着色剂可作为食品添加剂在食品加工中使用，但根据GB2760-2014《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》的规定，在动物性水产干制品中不允许使用该类着色剂。由于动物性水产干制品具有经济价值高、营养丰富的特点，深受消费者欢迎，但也催生了食品生产者违禁违规使用着色剂以提高卖相的现象。在GB/T9695.6-2008《肉制品胭脂红着色剂测定》和GB5009.35-2016《食品安全国家标准食品中合成着色剂的测定》中，均采用布氏漏斗法进行净化，液相色谱紫外检测器进行测定。但这两项方法均步骤繁杂，工作效率较低，急需对提取和净化方法进行改进，在利用液相色谱法进行多种着色剂的同时检测时，存在分离不完全，无法准确定性等缺陷。高洁等报道利用液相色谱法检测虾仁中的合成色素，其通过对提取剂、NH4Ac浓度和离子对种类等因素进行优化，将虾仁中常添加的包括酸性大红GR在内的5种染料完全分离，但是液相色谱法在准确定性方面存在疑问。林慧等利用超高效液相色谱/四极杆-飞行时间质谱建立了102种着色剂的定性筛查谱库，但在准确定量方面略显不足。目前非食用染料的检测以液相色谱和液相色谱-质谱联用仪为主，检测对象主要为饮料、豆制品、面粉等，宁尚勇等采用反相高效液相色谱法检测酸性大红GR等染料的仪器检出限为0.05-10μg/mL，但采用液相色谱-质谱联用法对水产干制品中的酸性偶氮类着色剂进行同时检测，且方法检出限达到0.1～1μg/kg，定量限达到0.25～25μg/kg的，目前还没有报道。徐雪芹等专利技术了一种纸质食品包装材料中酸性大红GR的测定方法，选用甲醇乙酸水溶液超声萃取样品，过滤膜后直接进入超高效液相色谱-四极杆质谱联用(UPLC-MS)进行测定，但是这种前处理方法不适用于动物性水产干制品这类蛋白质含量很高的基质。
技术实现思路
针对上述现有技术存在的问题，本专利技术的目的在于建立动物性水产干制品中酸性偶氮类着色剂的提取、净化和液质联用检测方法。由于酸性偶氮类着色剂在不同pH值时氢键吸附能力随之变化，在提取和净化过程中利用pH值的变化，发挥聚酰胺固相萃取柱高通量的优势，替代传统的布氏漏斗净化法，获得满意的回收率。液质联用检测方法可以对酸性偶氮类着色剂同时进行定性定量分析，获得高灵敏度和准确度。本专利技术具体技术方案如下：本专利技术的第一个目的是提供一种动物性水产干制品中酸性偶氮类着色剂的液质联用检测方法，将所述方法包括：S1：将动物性水产干制品样品均质、脱脂处理后，用碱性溶液进行提取，浓缩，得到待净化溶液；S2：将S1得到的待净化溶液调节pH值至3.0～4.0后，利用聚酰胺固相萃取柱净化，用碱性溶液进行洗脱，定容，备用；优选的，采用200g/L柠檬酸溶液将S1得到的待净化溶液调节pH值至3.0～4.0，促进试液中偶氮类着色剂在聚酰胺SPE柱上的吸附；S3：将S2所得样品用液相色谱-串联四级杆质谱联用仪进行定量检测。进一步的，所述酸性偶氮类着色剂包括酸性大红GR(CAS：5413-75-2)、酸性橙Ⅱ(CAS：633-96-5)、酸性红(CAS：3567-69-9)、苋菜红(CAS：633-96-5)、胭脂红(CAS：15876-47-8)、诱惑红(CAS：25956-17-6)、柠檬黄(CAS：1934-21-0)、日落黄(CAS：2783-94-0)、新红(CAS：220658-76-4)中的一种或多种的混合。进一步的，S1所述脱脂处理，具体为：采用石油醚对动物性水产干制品样品进行3次脱脂处理；酸性偶氮类着色剂为水溶性偶氮染料，而动物性水产干制品含油脂，在加入水溶性提取液时，易形成油包水结构，影响样品提取率；同时脱脂也是对样品进行初步净化，可以有效避免SPE净化小柱堵塞和过载。因此动物性水产干制品样品须进行脱脂处理。进一步的，S1所述提取，具体为：在脱脂处理所得样品中加入碱性溶液，超声提取5分钟，8000rpm离心5min，取上清液；重复上述步骤2次，合并上清液，得到提取液，所述碱性溶液为体积比7：2：1的乙醇-氨水-水溶液。优选的，所述提取中，每次加入碱性溶液的量为10mL。S1所述浓缩，具体为：于60℃氮气吹走提取液中的乙醇和氨，优选的，将所述提取液浓缩至5mL以下。蛋白质由氨基酸组成，每个氨基酸均含有羟基和氨基，酸性偶氮类着色剂在中性条件下会与蛋白质中的氨基酸分子形成吸附。所以利用乙醇-氨水-水(体积比为7：2：1)的碱性提取液进行提取，可以使酸性偶氮类着色剂分子与蛋白质分子解吸附，在提取液中呈游离状态，而乙醇-氨水-水(体积比为7：2：1)的碱性提取液可以使样品中的酸性偶氮类着色剂充分游离，从而达到最佳提取效果；且于60℃氮气浓缩至5mL以下时回收率均可达到95％以上。进一步的，S2所述聚酰胺固相萃取柱净化，为先在酸性环境下使着色剂和聚酰胺柱体形成吸附，再在碱性环境下洗脱着色剂；具体为：先用水活化SPE小柱(聚酰胺固相萃取柱)，将调节pH值至3.0～4.0后的所述样品提取液全部转移到聚酰胺固相萃取柱上，分别用水、甲醇-甲酸溶液(体积比6:4)和70℃水淋洗聚酰胺固相萃取柱，以去除天然色素和其他杂质。S2所述洗脱采用甲醇-1vol％氨水溶液，所述甲醇-1vol％氨水溶液中，甲醇与1vol％氨水溶液的体积比2：8。进一步的，S2所述定容，具体为：将洗脱液吹至近干后，用体积比2：8为的甲醇-1vol％氨水溶液定容至1mL，用聚四氟乙烯滤头过滤后备用。样品经溶剂提取浓缩后，存在残渣或杂质，采用聚四氟乙烯滤头过滤器对样品进行净化，能够有效防止液相色谱柱堵塞，避免污染串联四级杆质谱，保障筛查结果的准确性，延长仪器使用寿命。进一步的，S3所述液相色谱条件为：色谱柱为WatersAcquityUPLCRHSS-C18(2.1mm×50mm，1.8μM)；柱温40℃；流动相，甲醇(A)和10mM乙酸铵溶液(B)梯度洗脱(0min～2min，10％A；2min～5min，90％A；5min～7min，10％A)；流速0.2mL/min；进样量1μL。进一步的，S3所述质谱条件：电喷雾离子源(ESI)；雾化电压为5500V；离子源温度为550℃；气帘气压力为25psi；辅助加热气Gas1压力为50psi；辅助加热气Gas2压力为50psi；碰撞气压力为12psi。选择负离子质谱扫描方式；检测方式采用多反应监测模式(Multiplereactionmonitoring,MRM)。进一步的，S3所述定量为外标法定量，具本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种动物性水产干制品中酸性偶氮类着色剂的液质联用检测方法,其特征在于，将所述方法包括：/nS1：将动物性水产干制品样品均质、脱脂处理后，用碱性溶液进行提取，浓缩，得到待净化溶液；/n优选的，S1所述脱脂处理，具体为：采用石油醚对动物性水产干制品样品进行3次脱脂处理；/nS2：将S1得到的待净化溶液调节pH值至3.0～4.0后，利用聚酰胺固相萃取柱进行净化，用碱性溶液进行洗脱，定容，备用；/n优选的，S2中采用200g/L柠檬酸溶液将S1得到的待净化溶液调节pH值至3.0～4.0；/nS3：将S2所得样品用液相色谱-串联四级杆质谱联用仪进行定量检测；/n优选的，S3中所述定量方法为外标法定量，以各物质定量离子在质谱上的响应面积为纵坐标，以标准溶液的浓度为横坐标绘制标准曲线，得到线性方程及相关系数。/n

【技术特征摘要】
1.一种动物性水产干制品中酸性偶氮类着色剂的液质联用检测方法,其特征在于，将所述方法包括：
S1：将动物性水产干制品样品均质、脱脂处理后，用碱性溶液进行提取，浓缩，得到待净化溶液；
优选的，S1所述脱脂处理，具体为：采用石油醚对动物性水产干制品样品进行3次脱脂处理；
S2：将S1得到的待净化溶液调节pH值至3.0～4.0后，利用聚酰胺固相萃取柱进行净化，用碱性溶液进行洗脱，定容，备用；
优选的，S2中采用200g/L柠檬酸溶液将S1得到的待净化溶液调节pH值至3.0～4.0；
S3：将S2所得样品用液相色谱-串联四级杆质谱联用仪进行定量检测；
优选的，S3中所述定量方法为外标法定量，以各物质定量离子在质谱上的响应面积为纵坐标，以标准溶液的浓度为横坐标绘制标准曲线，得到线性方程及相关系数。


2.根据权利要求1所述的动物性水产干制品中酸性偶氮类着色剂的液质联用检测方法，其特征在于，所述酸性偶氮类着色剂包括酸性大红GR、酸性橙Ⅱ、酸性红、苋菜红、胭脂红、诱惑红、柠檬黄、日落黄、新红中的一种或多种的混合。


3.根据权利要求1所述的动物性水产干制品中酸性偶氮类着色剂的液质联用检测方法，其特征在于，S1所述提取，具体为：向脱脂处理所得样品中加入碱性溶液，超声提取5分钟，8000rpm离心5min，取上清液；重复上述步骤2次，合并上清液，得到提取液；
S1所述碱性溶液为体积比7：2：1的乙醇-氨水-水溶液；
S1所述浓缩，具体为：于60℃氮气吹走提取液中的乙醇和氨，优选的，将所述提取液浓缩至5mL以下。


4.根据权利要求1所述的动物性水产干制品中酸性偶氮类着色剂的液质联用检测方法，其特征在于，S2所述净化，具体为：先用水活化聚酰胺固相萃取柱，将调节pH值至3.0～4.0后的所述样品提取液全部转移到聚酰胺固相萃取柱上，分别用水和体积比为6:4的甲醇-甲酸溶液和70℃水淋洗聚酰胺固相萃取柱，以去除天然色素和其他杂质。


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【专利技术属性】
技术研发人员：颜春荣，高惠敏，林慧，徐春祥，张征，
申请(专利权)人：江苏省食品药品监督检验研究院，
类型：发明
国别省市：江苏;32