一种抗草甘膦油菜的培育方法技术

本发明专利技术属于植物基因工程领域。涉及一种抗草甘膦油菜的培育方法。构建包含目标基因I.variabilis‑EPSPS*的表达载体pTGH‑1，利用农杆菌介导的遗传转化将转化载体导入甘蓝型油菜受体细胞中，在含有草甘膦的愈伤组织诱导培养基上筛选得到抗性愈伤组织；将抗性愈伤组织转移至分化培养基上诱导分化，当分化的外植体上再生出完整的芽时，置于生根培养基上得到再生苗。提取T

A cultivation method of glyphosate resistant rape

【技术实现步骤摘要】
一种抗草甘膦油菜的培育方法
本专利技术属于植物基因工程
，具体涉及一种抗草甘膦油菜新品种的培育方法。
技术介绍
草甘膦具有除草性能高效，成本低廉、生态风险较小等优点，是应用最为广泛的广谱性除草剂之一。对该除草剂抗性基因的研究证明，对草甘膦的抗性主要由EPSPS突变基因控制。加拿大等西方国家有关公司已培育了一系列的抗草甘膦转基因油菜品种，已在多国取得了商业生产证书。这些品种的推广将会极大的冲击我国在国际油菜市场地位。草甘膦通过抑制5-磷酸烯醇式丙酮酸莽草酸-3磷酸合酶(EPSPS)的活性阻断莽草酸路径，使植物芳香族氨酸合成受阻(DukeSO,PowlesSB.Glyphosate:aonce-in-a-centuryherbicide.PestManagSci,2008,64:319-325；GruysKJ,MarzabadiMR,PansegrauPD,SikorskiJA.Steady-statekineticevaluationofthereversereactionforEscherichiacoli5-enolpyruvoylshikimate-3-phosphatesynthase.ArchBiochemBiophys,1993,304:345-351)，从而导致植物死亡。在实际应用中,植物草甘磷抗性一般都是通过异源表达外源的非敏感EPSP合成酶(ZelayaIA,OwenMD.DifferentialresponseofAmaranthustubercμLatus(MoqexDC)JDSauertoglyphosate.PestManagSci,2005,61:936-950)实现的。本研究所用外源非敏感EPSP合成酶I.variabilis-EPSPS*基因是华中农业大学从Isoptericolavariabilis中克隆到抗草甘膦基因。I.variabilis-EPSPS*基因编码的蛋白不具有CP4-EPSPS专利保护的4条保守序列，具有类似I型EPSPS的保守序列但是与专利保护的抗草甘膦I型EPSPS不冲突，是具有自主知识产权的抗草甘膦基因(CuiY,HuangSQ,LiuZD,YiSY,ZhouF,ChenH,LinYJ.DevelopmentofNovelGlyphosate-TolerantJaponicaRiceLines:AStepTowardCommercialRelease.FrontiersinPlantScience,2016,7)草害是是制约我国油菜(Brassicanapus)生产发展的主要因素之一。去除油菜田间杂草的方法主要有人工除草和施用化学除草剂。人工除草耗时长，用工量大，明显增加了田间作业成本，导致农民效益降低，也制约了油菜的机械化规模化种植。化学除杂草成本低，快速高效，已成为机械化直播的重要配套栽培措施。油菜是我国重要的经济作物，故发展转I.variabilis-EPSPS*油菜对于我国油菜产业产业化发展具有重要意义。第一，中国常年杂草发生面积接近0.97亿公顷，相当于作物种植面积的80％，草害是影响油菜高产、优质的障碍之一，草害可造成油菜每年减产达15-20％。第二，我国油莱主产区长江流域冬油菜区(占全国油莱面积85％以上)以双子叶杂草为主，由于油菜对防除双子叶杂草的除草剂极为敏感，目前还没有对双子叶类的阔叶杂草理想的除草剂可用。第三，草甘膦及其代谢物对土壤中动物和微生物无害，同时在土壤中易降解，不影响土壤结构，不残留在土壤中影响后茬作物。第四，通过大规模的筛选，目前尚未在油菜中找到有效控制草害的抗性基因资源。因此，通过转基因培育抗草甘膦油菜是解决上述问题的最有效途径。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术存在的缺陷，提供一种抗草甘膦油菜的培育方法。在本专利技术中，基因转化的受体品种为甘蓝型油菜甲A177(甘蓝型油菜甲A177系一种小粒纯系，申请人将该品种命名为甘蓝型油菜甲A177，于2009年11月20日送交中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏编号为CCTCCNO：P200908；在先专利技术专利申请的申请号为201010169042X，公开号为：CN101962640A，公开日为：2011年02月02日)。所使用的抗草甘膦基因I.variabilis-EPSPS*(该基因的原始序列由华中农业大学生命科技学院刘子铎教授课题组克隆并提供(来源于微生物材料)(YiSY,WuGB,LinYJ,HuN,LiuZD.Characterizationofanewtypeofglyphosate-tolerant5-enolpyruvylshikimate-3-phosphatesynthasefromIsoptericolavariabilis.JournalofMolecμLarCatalysisBEnzymatic,2015,111:1-8)，对原始序列进行密码子优化并合成的工作由华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室林拥军教授课题组完成(CuiY,HuangSQ,LiuZD,YiSY,ZhouF,ChenH,LinYJ.DevelopmentofNovelGlyphosate-TolerantJaponicaRiceLines:AStepTowardCommercialRelease.FrontiersinPlantScience,2016,7)。采用农杆菌介导的甘蓝型油菜遗传转化法，将所述的抗草甘膦基因I.variabilis-EPSPS*导入受体油菜甲A177。通过PCR方法检测转化植株阳性率，利用Southern杂交确定其拷贝数，通过反向PCR方法分离得到侧翼序列，利用RT-PCR确定的表达，草甘膦抗性鉴定试验确定转基因油菜对草甘膦的抗性等过程，最终获得单拷贝整合在基因间区且I.variabilis-EPSPS*基因表达正常的高抗且其农艺性状与原品种没有显著差别的草甘膦油菜株系EPSPSP-X6。本专利技术公开了油菜遗传转化程序、转化植物的分子鉴定、插入位点的序列分析、草甘膦抗性鉴定等过程。本专利技术的具体步骤是：以pCAMBIA1300质粒为起始质粒，构建包含目标基因I.variabilis-EPSPS*的表达载体pTGH-1。与此同时，将甘蓝型低芥酸油菜甲A177种子消毒后步骤在播种培养基上进行暗光培养；然后将含有目标基因I.variabilis-EPSPS*的表达载体pTGH-1的农杆菌与组培后的甘蓝型油菜下胚轴经农杆菌制备的工程菌菌液(侵染液)侵染后在共培养培养基上进行共掊养，在含有草甘膦(glyphosate)的愈伤组织诱导培养基上筛选得到抗性愈伤组织；将抗性愈伤组织转移至分化培养基上诱导分化，当分化的外植体上再生出完整的芽时，切掉外植体上的原生根，将其置于生根培养基上进行生根培养；当新生根长到3cm左右时，转移到温室进行壮苗后在大田栽种。这些再生苗即为T0代转基因植株。在T0代植株生长期间，采用CTAB法提取叶片基因组DNA，通过Southern杂交鉴定基因的拷贝数；随后，将单本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种抗草甘膦油菜的培育方法，其特征包括下列步骤：/nA、以pCAMBIA1300质粒为起始质粒，构建包含如SEQ ID NO:1所示序列的目标基因I.variabilis-EPSPS*的表达载体pTGH-1；将甘蓝型低芥酸油菜甲A177种子消毒后接种在播种培养基上进行暗培养；然后将含有目标基因的表达载体pTGH-1的农杆菌工程菌与甘蓝型油菜下胚轴用侵染液侵染后在共培养培养基上进行共掊养，在含有草甘膦的愈伤组织培养基上筛选得到抗性愈伤组织；将抗性愈伤组织转移至分化培养基上诱导分化；当分化的外植体上再生出完整的芽时，切掉原生根，并置于生根培养基上进行生根培养；当新生根长到3cm时，转移至温室，将壮苗后的再生苗移植到大田栽种，即为T

【技术特征摘要】
1.一种抗草甘膦油菜的培育方法，其特征包括下列步骤：
A、以pCAMBIA1300质粒为起始质粒，构建包含如SEQIDNO:1所示序列的目标基因I.variabilis-EPSPS*的表达载体pTGH-1；将甘蓝型低芥酸油菜甲A177种子消毒后接种在播种培养基上进行暗培养；然后将含有目标基因的表达载体pTGH-1的农杆菌工程菌与甘蓝型油菜下胚轴用侵染液侵染后在共培养培养基上进行共掊养，在含有草甘膦的愈伤组织培养基上筛选得到抗性愈伤组织；将抗性愈伤组织转移至分化培养基上诱导分化；当分化的外植体上再生出完整的芽时，切掉原生根，并置于生根培养基上进行生根培养；当新生根长到3cm时，转移至温室，将壮苗后的再生苗移植到大田栽种，即为T0代转基因植株；
B、在T0代植株生长期间，用CTAB法提取T0代植株叶片基因组DNA，通过Southern杂交鉴定基因的拷贝数；将单拷贝的植株种成株系；通过田间抗性调查和PCR检测，种子成熟后，收获T0代植株上的种子，即为T1代种子；
C、在收获T1代种子的第二年，挑选转基因纯合株系进行室内和田间抗草甘膦试验，调查其农艺性状；
D、采用反向PCR和Tail-PCR方法，对抗草甘膦抗性有差别的单株作侧翼序列分析，获得高抗除草剂草甘膦的转基因油菜株系；
其中：
上述步骤中所用的培养基成分及其配制如下所述：
1)播种培养基：
以配制500mL培养基计:1/2MS1.1g，蔗糖15g，用蒸馏水定容至500mL，pH5.84-5.88，加琼脂粉3.5g；
2)共培养培养基：
以配制500mL培养基计:MS2.2g，蔗糖15g，甘露醇l9g，2,4-D500μL，激动素500μL，用蒸馏水定容至500mL，pH5.84-5.88，加琼脂粉3.5g；使用时快冷时加入500u的乙酰丁香酮；
3)侵染液：
以配制100mL培养基计：MS0.44g，蔗糖3g，用蒸馏水定容至500mL，pH5.84-5.88，灭菌后使用时加入100μL的乙酰丁香酮；
4)愈伤组织诱导培养基：
以配制500mL培养基计:MS2.2g，蔗糖15g，甘露醇l9g，2,4-D500μL，激动素500μL，用蒸馏水定容至500mL，调pH值5.84-5.88，加琼脂粉3.5g；灭菌后使用时加STS75μL，特美汀500μL，草甘膦400μL。
5)分化培养基

【专利技术属性】
技术研发人员：周永明，李杰华，黄会斌，林拥军，刘子铎，范楚川，張椿雨，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42