CRISPR-Cas9特异性敲除大豆脂肪氧化酶基因的方法及其应用技术

本发明专利技术公开了CRISPR‑Cas9特异性敲除大豆脂肪氧化酶基因的方法及其应用，属于大豆分子育种和生物技术领域。该方法包括：在大豆脂肪氧化酶基因编码区设计同时靶向高度同源的

【技术实现步骤摘要】
CRISPR-Cas9特异性敲除大豆脂肪氧化酶基因的方法及其应用
本专利技术属于大豆分子育种和生物
，具体涉及CRISPR-Cas9特异性敲除大豆脂肪氧化酶基因的方法及其应用。
技术介绍
大豆（Glycinemax(L.)Merr.）起源于中国，是我国乃至世界主要栽培作物之一，也是人类以及家禽和家畜摄取植物蛋白和脂肪的重要来源，在我国农业生产中占有举足轻重的地位（韩立德等,2003;毕影东等,2014;潘文华和许世卫,2014;张亚楠,2017）。但是，在大豆及其制品的储藏、加工过程中大豆子叶中的脂肪氧化酶（Lipoxygenase,LOX）能专一催化具有顺-1.4-戊二烯结构的多元不饱和脂肪酸的加氧反应，形成过氧化氢衍生物（Axelrodetal.,1981），最后分解成小分子的醛、醇和酮等挥发性物质，产生豆腥味和苦涩味（Brash,1999;LiavonchankaandFeussner,2006），严重影响其食用品质以及储藏性和营养价值（Rackisetal.,1979）。大豆生产加工中往往采用加热或微波处理的方法使其脱腥，这一过程耗资费力。去除豆腥味经济而又治本的方法是选育脂肪氧化酶缺失的无豆腥味大豆品种。常规育种中，往往需要lox突变体与优良品种杂交，之后经多代回交或自交而选育出无豆腥味大豆品种，这是一个费时费力的过程。CRISPR-Cas9（Clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeatsassociatednuclease9）是继锌指核酸内切酶（ZFN）和类转录激活因子效应物核酸酶（TALEN）之后出现的新一代基因定点编辑技术，因其操作简单、周期短、效率高等优点，一经问世（Congetal.,2013;Malietal.,2013）便迅速发展为基因功能解析、作物遗传改良和新品种培育等领域备受瞩目的技术（Upadhyayetal.,2013;Liangetal.,2014;Sunetal.,2016;Caietal.,2018）。其工作原理为：CRISPR-Cas9系统中，外源单链向导RNA（SingleguideRNA,sgRNA）指引内切酶蛋白Cas9在靶点位置进行切割并产生双链DNA断裂（Double-strandedDNAbreaks,DSBs）（Jineketal.,2012）；随后，DSBs诱导DNA自我修复机制，通过非同源末端连接（NonhomologousEndJoining,NHEJ）或同源重组（HomologyDirectedRepair,HDR）在断裂位置引入小片段的插入/缺失或精确的定点替换/插入，导致基因功能缺失（Shanetal.,2013;Svitashevetal.,2015）。目前，CRISPR-Cas9系统已成功应用于大豆GmFT2a、FAD2-2和GmSPL9等基因突变体的创制（Caietal.,2018;Aminetal.,2019;Baoetal.,2019），表明利用CRISPR-Cas9技术对大豆农艺性状进行遗传改良是可行的。大豆脂肪氧化酶包含3种同工酶，即Lox1、Lox2和Lox3，分别由Glyma.13g347600（GmLox1）、Glyma.13g347500（GmLox2）和Glyma.15g026300（GmLox3）编码合成。通过CRISPR-Cas9系统同时敲除3个GmLox基因可以快速创制无豆腥味大豆新种质。CRISPR-Cas9是由人工设计的sgRNA来介导基因组特定位点的切割，因此能否成功设计出精确靶向的sgRNA是该路径的关键技术难题。本专利技术意在解决该技术难题从而为创制无豆腥味大豆新种质提供新途径。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供CRISPR-Cas9特异性敲除大豆脂肪氧化酶基因的方法及其应用。为了实现上述目的，本专利技术采用以下技术措施：一种CRISPR-Cas9特异性敲除大豆脂肪氧化酶基因的方法，包括以下步骤：（1）在大豆脂肪氧化酶基因编辑位点设计并合成两种sgRNA，sgRNA-GmLox1/2和sgRNA-GmLox3；其中，sgRNA-GmLox1/2同时靶向高度同源的GmLox1和GmLox2，sgRNA-GmLox3则靶向GmLox3。（2）以大豆专用CRISPR/Cas9基因编辑载体pGES201为骨架针对每个sgRNA单独构建CRISPR-Cas9基因敲除载体并转化农杆菌GV3101；（3）携带CRISPR-Cas9基因敲除载体的农杆菌GV3101以混池的方式混合侵染大豆子叶节，进行大豆的稳定转化；（4）在T0代稳定转化苗中进行阳性植株的筛选、sgRNA分布情况的鉴定以及靶向基因编辑情况的检测；（5）在T1代-T2代筛选T-DNA与编辑位点分离的GmLox全缺失突变体。上述步骤（1）中所述大豆脂肪氧化酶基因编辑位点的准确定位是在大豆基因组（Wm82.a2）13号染色体GmLox1编码区2号外显子（染色体坐标为43769605-43769627）和GmLox2编码区2号外显子（染色体坐标为43762424-4376244），以及15号染色体GmLox3编码区3号外显子（染色体坐标为2125132-2125154）；所述sgRNA-GmLox1/2的核苷酸序列为：5’-GGAAAGGATACGTTCTTGGAAGG-3’；sgRNA-GmLox3的核苷酸序列为；5’-CCTTTCCTTATCCTCGTAGGGGG-3’；sgRNA-GmLox1/2和sgRNA-GmLox3的3’端含有AGG或GGG，作为Cas9核酸内切酶特异识别的PAM序列，能够指引内切酶蛋白Cas9在靶点位置进行切割并产生双链DNA断裂，从而在断裂位置引入小片段的插入/缺失或精确的定点替换/插入，导致基因功能缺失。上述步骤（2）中CRISPR-Cas9基因敲除载体的构建为：sgRNA正义和反义寡核苷酸链退火为双链，以CRISPR-Cas9基因编辑载体pGES201为骨架，将sgRNA退火双链连接至载体pGES201上，连接产物转化至大肠杆菌感受态细胞，检测获得阳性克隆并提取重组质粒，获得CRISPR-Cas9基因敲除载体；该载体以pGmU6启动子启动sgRNA的表达，大豆内源启动子pM4启动Cas9的表达。进一步的，上述sgRNA正义和反义寡核苷酸链，其中sgRNA-GmLox1/2的正义寡核苷酸链为：5’-GGATTGGAAAGGATACGTTCTTGGA-3’，反义寡核苷酸链为5’-AAACTCCAAGAACGTATCCTTTCCA-3’；sgRNA-GmLox3的正义寡核苷酸链为：5’-GGATTGCCTTTCCTTATCCTCGTAGG-3’，反义寡核苷酸链为5’-AAACCCTACGAGGATAAGGAAAGGCA-3’。上述步骤（3）中侵染大豆子叶节，优选大豆品种为“华春6号”。上述一种CRISPR-Cas9特异性敲除大豆脂肪氧化酶基因的方法在选育无豆腥味大豆种质中的应用。<本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种CRISPR-Cas9特异性敲除大豆脂肪氧化酶基因的方法，其特征在于，包括以下步骤：/n（1）在大豆脂肪氧化酶基因编辑位点设计并合成两种sgRNA，sgRNA-

【技术特征摘要】
1.一种CRISPR-Cas9特异性敲除大豆脂肪氧化酶基因的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）在大豆脂肪氧化酶基因编辑位点设计并合成两种sgRNA，sgRNA-GmLox1/2和sgRNA-GmLox3；其中，sgRNA-GmLox1/2同时靶向高度同源的GmLox1和GmLox2，sgRNA-GmLox3靶向GmLox3；
（2）以大豆专用CRISPR/Cas9基因编辑载体pGES201为骨架针对每个sgRNA单独构建CRISPR-Cas9基因敲除载体并转化农杆菌GV3101；
（3）携带CRISPR-Cas9基因敲除载体的农杆菌GV3101以混池的方式混合侵染大豆子叶节，进行大豆的稳定转化；
（4）在T0代稳定转化苗中进行阳性植株的筛选、sgRNA分布情况的鉴定以及靶向基因编辑情况的检测；
（5）在T1代-T2代筛选T-DNA与编辑位点分离的GmLox全缺失突变体。


2.根据权利要求1所述的一种CRISPR-Cas9特异性敲除大豆脂肪氧化酶基因的方法，其特征在于：步骤（1）中所述大豆脂肪氧化酶基因编辑位点的准确定位是在大豆基因组13号染色体GmLox1编码区2号外显子，和GmLox2编码区2号外显子；以及15号染色体GmLox3编码区3号外显子；所述sgRNA-GmLox1/2的核苷酸序列为：5’-GGAAAGGATACGTTCTTGGAAGG-3’；sgRNA-GmLox3的核苷酸序列为；5’-CCTTTCCTTATCCTCGTAGGGGG-3’；sgRNA-GmLox1/2和sgRNA-GmLox3的3’端含有AGG或GGG，作为Cas9核酸内切酶特异识别的PAM序列，能够指引内切酶蛋白Cas9在靶点...

【专利技术属性】
技术研发人员：关跃峰，王杰，匡华琴，
申请(专利权)人：福建农林大学，
类型：发明
国别省市：福建;35