纹枯病菌微小RNA、其对玉米基因的调控作用及其应用制造技术

本发明专利技术涉及植物生物技术领域，具体涉及一个立枯丝核菌致病力相关的微小RNA(microRNA)Rhi‑milR‑9829‑5p对玉米基因GRMZM2G412674的调控作用及其应用。在纹枯病菌侵染玉米的过程中，Rhi‑milR‑9829‑5p的表达量发生显著变化，并且与玉米基因GRMZM2G412647的表达量呈现较高程度的线性负相关。利用双荧光素酶报告系统，验证了玉米基因GRMZM2G412647的表达受到Rhi‑milR‑9829‑5p的负调控。这证明Rhi‑milR‑9829‑5p能够调控玉米基因的表达，为微小RNA参与跨物种分子调控提供了证据，有可能应用于玉米抗纹枯病的分子育种。

MicroRNA of Rhizoctonia solani, its regulatory effect on maize gene and its application

【技术实现步骤摘要】
纹枯病菌微小RNA、其对玉米基因的调控作用及其应用
本专利技术属于植物基因工程
，尤其涉及纹枯病菌微小RNA、其对玉米基因的调控作用及其应用。
技术介绍
玉米是我国重要的粮食作物，随着种植面积不断扩大，农药化肥使用量不断增加，病虫害越来越成为玉米增产的限制因素。其中，由立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani)侵染引起的玉米纹枯病，是玉米生产最常见的真菌病害之一，在部分地区已成为玉米生产的第一大病害，个别田块和品种发病率甚至达到100％(贾雷娜等，2013，安徽农学通报，19:64,79)，严重影响了玉米的品质和产量。通过遗传改良提高玉米抗病性是解决这一农业问题的有效途径之一，而纹枯病菌-玉米互作调控机制的阐明，将为通过分子育种培育抗病品种提供理论依据。在长期的进化过程中，植物的免疫系统和病原菌的致病能力互相博弈并各自完善。病原菌入侵植物后，若植物产生免疫反应，则能够抑制死病原菌生长；反之，病原菌在植物体内繁殖，则会引起相应病症。植物的先天免疫系统由两个主要的免疫反应组成，即病原相关分子模式(Pathogenassociatedmolecularpattern,PAMP)激发的免疫反应(PTI)和效应蛋白(effector)激发的免疫反应(ETI)。目前，在革兰氏阴性菌中已鉴别出鞭毛蛋白(flg22)、脂多糖等可作为病原相关分子激发PTI反应，而真菌中的麦角甾醇、几丁质等也有类似功能(Nürnberger等，2004，Immunol.Rev.198:249-266；Zipefel等，2005，Curr.Opin.PlantBiol.8:353-360)。同时，植物中发现了大量编码抗病效应蛋白的抗病基因，如Hm1、Rpg1、Mla1等，它们能够激活特异性防卫反应的信号转导系统(Jones和Dangl，2006，Nature444:323-329)。相应地，病原菌也进化出一系列的致病机制来应对植物的防御反应。通常病原菌会分泌一些效应蛋白来应对植物的防御反应，如AvrPtoB(Xiang等，2011，Mol.PlantMicrobeInteract.24:100-107)、T3SSHopF2、HopAI1(Wang等，2010，PlantCell22:2033-2044)等，这些效应因子是毒性因子或毒性效应蛋白，通过干扰寄主的正常生理功能提高病原菌的致病力。MicroRNA(miRNA)是一类非编码的单链小分子RNA，长度一般为18-25nt，广泛存在于动物、植物及低等真核生物的基因组中。它可以通过与靶基因的mRNA结合，引起靶基因mRNA的降解或者阻止mRNA的翻译，从而在转录或者转录后水平上对靶基因发挥负调控作用。一般来说，当miRNA与靶基因mRNA完全互补时，miRNA会促使mRNA被降解；当miRNA与靶基因mRNA不完全互补时，则会抑制mRNA的翻译过程(Wahid等，2010，Biochim.Biophys.Acta.1803:1231-1243；Mallory和Bouché，2008，TrendsinPlantSci.13:359-367)。由此可见，miRNA作为基因调控路径中的一类负调控子，能够在转录后水平直接控制下游靶基因的表达量。目前越来越多的研究表明，miRNA参与了真菌与寄主的互作调控过程(Zhang等，2011，Mol.Cell42:356-366)。一方面，植物体内miRNA的表达受到病原调控。利用高通量测序技术，Yin等(Yin等，2012，PLoSOne7：e35765)发现棉花中miR482、miR1444和miR2118等65个miRNA受到黄萎病病菌(Verticilliumdahliae)侵染的诱导或抑制。Chen等(Chen等，2012，Planta235:873-883)在北京杨(Populusbeijingensis)中鉴定出74个保守性miRNA和27个新miRNA的表达量受到溃疡菌(Dothiorellagregaria)的调控。虽然miRNA同一家族不同成员之间的核酸序列大体一致，但在同一致病环境下存在不同的表达调控方式。例如miR166家族在毛果杨中有16个成员，在受到葡萄座腔菌(Botryosphaeriadothidea)的侵染时，其中13个成员(miR166a-m)的表达量在接种后3天、5天、7天呈现连续上升的趋势，而miR166n、miR166o和miR166q的表达量则呈现先上升后下降的变化趋势(Zhao等，2012，PLoSOne7：e44968)。以上研究表明miRNA不仅应答植物真菌病害胁迫，而且参与真菌与植物的互作调控过程。另一方面，随着真菌中越来越多的miRNA被发现(Jiang等，2012，PLoSOne7：e52734；Lau等，2013，PLoSNegl.Trp.Dis.7:e2398；Raman等，2013，BMCGenomics14:326)，真菌自身的miRNA也被发现通过直接调控寄主靶基因参与致病过程。Weiberg等(Weiberg等，2013，Science342:118-123)发现灰霉菌(Botrytiscinerea)中的miRNA能够通过干扰拟南芥、烟草等寄主中的RNAi途径抑制寄主抗性，增强其自身的致病力。该研究首次证明真菌中miRNA能够作为效应因子直接作用于寄主中的靶基因从而调控真菌-寄主的互作，但相关机制在其它物种与病原菌互作中尚未得到证实。因此，研究miRNA在纹枯菌与玉米的互作过程中的调控机制，能够为验证病原miRNA作为广谱致病因子提供实验证据，并有望为玉米耐/抗病的转基因分子育种提供新的育种设计方案。目前，Zheng等(Zheng等，2013，Nat.Commun.4:1424-1433)应用全基因组鸟枪法测序，得到了纹枯菌(AG1IA)中6452个重叠群序列(contigsequences)，并对其中6156个基因进行了功能注释，发现257个与病原菌-寄主互作有关的基因。这些序列信息为纹枯菌中miRNA的生物信息学预测及靶基因分析提供了依据。而玉米B73自交系作为纹枯病的感病品系，其全基因组测序已经完成。应用新兴的大规模测序技术和全基因组关联分析(Genome-wideassociationstudy,GWAS)，研究者已经在水稻(Silva等，2012，Theor.Appl.Genet.124:63-74)、玉米(Kump等，2011，Nat.Genet.43:163-168)中对纹枯菌侵染过程中所有基因的表达量进行了检测，建立了此过程中受诱导和抑制基因的表达谱。这为我们寻找纹枯菌miRNA在玉米中的靶基因进而研究纹枯菌miRNA对玉米基因的表达调控奠定了理论基础。miRNA及其靶基因则为利用转基因技术进行作物改良提供了新的丰富候选资源，目前基于miRNA机制的转基因技术成为新的研究热点。植物miRNA应用于作物抗病育种具有明显优势：(1)许多基因在植物体内存在冗余现象，单纯敲除或过量表达某个基因并不能明显改变植物性状，而miRNA由于特异性地与靶向序列结合，因而可以一次性调控整个本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.纹枯病菌微小RNA Rhi-milR-9829-5p，其特征在于，其序列如序列表SEQ ID NO.1所示。/n

【技术特征摘要】
1.纹枯病菌微小RNARhi-milR-9829-5p，其特征在于，其序列如序列表SEQIDNO.1所示。


2.根据权利要求1所述纹枯病菌微小RNARhi-milR-9829-5p对玉米基因GRMZM2G4...

【专利技术属性】
技术研发人员：李晓明，储昭辉，孟红绪，丁香玉，
申请(专利权)人：山东农业大学，
类型：发明
国别省市：山东;37