检测血液中丙戊酸的方法技术

本发明专利技术的检测血液中丙戊酸的方法包括：制备丙戊酸标准储备液、制备丙戊酸的标准中间液、制备内标工作液、制备标准溶液和利用液相色谱‑质谱联用仪检测标准溶液，拟合得到丙戊酸对应的标准曲线方程为：y

The method of detecting valproic acid in blood

【技术实现步骤摘要】
检测血液中丙戊酸的方法
本专利技术涉及生物检测
，特别涉及一种检测血液中丙戊酸的方法。
技术介绍
丙戊酸化学结构式和药理作用独特，对人的各型癫痫如对各型小发作、肌阵挛性癫痫、局限性发作、大发作和混合型癫痫均有效。多用于其它抗癫痫药无效的各型癫痫病人，尤以小发作为最佳，故对丙戊酸的监测具有重要的临床意义。目前，检测服用丙戊酸的患者的血液样本时，通常采用高效液相色谱法进行测试。但是，通过上述方法检测血液样本中的丙戊酸含量时，需要对血液样本进行前处理，例如，萃取。由于萃取处理的时间通常较长，从而使得检测时间长，导致血液样本的检测效率低。
技术实现思路
本申请的专利技术目的是提供了一种检测血液中丙戊酸的方法，能够提高血液样本的检测效率。本专利技术的检测血液中丙戊酸的方法，其中：它包括以下步骤：(一)标准溶液的标定(a)制备丙戊酸标准储备液把购买的有证丙戊酸标准溶液转移至2mL冻存管中，得到1mg/mL的丙戊酸标准储备液，在-80℃条件下保存；(b)制备丙戊酸的标准中间液用含水量为10％～80％甲醇稀释液稀释上述丙戊酸标准储备液，制成含有浓度为2.5mg/L～160mg/L的丙戊酸的至少三种丙戊酸的标准中间液，并在-80℃条件下保存；(c)制备内标工作液用含水量为10％～80％甲醇稀释液稀释1mg/mL的丙戊酸-d6储备液，得到一种含有10～50mg/L丙戊酸-d6的内标工作液，并在-80℃条件下保存；(d)制备标准溶液分别移取10μL上述至少三种浓度的丙戊酸标准中间液，在上述每一种丙戊酸标准中间液中分别加入10μL的内标工作液和180μL含水量为70％甲醇稀释液，并在转速为1000～2000rpm下涡旋混匀30s～1min，制成至少三种不同浓度的标准溶液，其中，每一种浓度的标准溶液中包含的内标物的浓度相同；(e)拟合标准曲线方程利用液相色谱-质谱联用仪检测上述每一种浓度的标准溶液，得到至少三种不同浓度的标准溶液的丙戊酸和丙戊酸-d6的图谱；从上述每种浓度的标准溶液的图谱中分别得到丙戊酸的色谱峰峰面积和丙戊酸-d6的色谱峰峰面积，分别以上述至少三种不同浓度的标准溶液中的丙戊酸的色谱峰峰面积与丙戊酸-d6的色谱峰峰面积的比值作为标准曲线方程的纵坐标y1，以上上述至少三种不同浓度的标准溶液中的丙戊酸的浓度与丙戊酸-d6的浓度的比值作为标准曲线的横坐标x1，将上述检测所得的至少三种不同浓度的数据进行线性回归，拟合得到丙戊酸对应的标准曲线方程为：y1＝a*x1+b，并且得到权重系数a和b；(二)待测血液样本的处理取待测血液至少2mL，在离心速度3500rpm下离心10min，提取待测血液的上清液，并在-20℃条件下保存；移取步骤(c)的丙戊酸-d6的内标工作液10μL于1.5mL离心管中，再加入上述待测血液的上清液10μL，在1500rpm的转速下涡旋震荡混合30s，然后再在上述离心管中加入80μL沉淀蛋白试剂，在2000rpm的转速下涡旋震荡混合3min，以达到充分沉淀蛋白的目的，再在10000-15000rpm的转速下高速离心10min，得到上清液，取上清液50μL，加入含水量为70％的甲醇溶液50μL，得到待测血液样本；(三)待测血液样本的检测利用液相色谱-质谱联用仪检测上述待测血液样本，得到待测血液样本中的丙戊酸的色谱峰峰面积和丙戊酸-d6的色谱峰峰面积；将待测血液样本中的丙戊酸的色谱峰峰面积与丙戊酸-d6的色谱峰峰面积的比值作为y1，代入步骤(e)得到的y1＝a*x1+b公式中，计算得到待测血液样本中的丙戊酸的浓度与丙戊酸-d6的浓度的比值x1，由于上述待测血液样本中，丙戊酸-d6的浓度为已知，由此计算出待测血液样本中的丙戊酸浓度。本专利技术的检测血液中丙戊酸的方法，其中：在步骤(b)中，制备七种含有不同浓度丙戊酸的标准中间液，它们分别是含有2.5、5、10、20、40、80、160mg/L丙戊酸浓度的标准中间液。本专利技术的检测血液中丙戊酸的方法，其中：在步骤(b)中，所述甲醇稀释液为含水量70％甲醇溶液。本专利技术的检测血液中丙戊酸的方法，其中：在步骤(二)中，所加入的沉淀蛋白试剂为乙腈。本专利技术的检测血液中丙戊酸的方法，其中：在步骤(c)中，用含水量为70％甲醇稀释液稀释丙戊酸-d6储备液，得到一种含有20mg/L丙戊酸-d6的内标工作液。本专利技术的检测血液中丙戊酸的方法，其中：所述液相色谱-质谱联用仪的色谱条件包括：C18反向色谱柱；柱温为20～40℃；流动相为：含8mM乙酸铵的水溶液和纯甲醇溶液，上述水溶液与上述纯甲醇溶液的梯度洗脱时间不小于6.0min；流动相的流速为0.2～0.5mL/min。本专利技术的检测血液中丙戊酸的方法，其中：所述液相色谱-质谱联用仪的质谱条件包括：液相色谱-质谱联用仪的质谱检测器为ESI(+)模式；离子源参数包括：气流量为8～50L/min，喷雾量为20～50L/min，气体温度为300～400℃，毛细管电压为3000～5000V。本专利技术的检测血液中丙戊酸的方法，其中：所述C18反向色谱柱为AgilentPoroshell120EC-C18。本专利技术的检测血液中丙戊酸的方法，其中：所述液相色谱-质谱联用仪的在线过滤器为SSICOLPRE-FILTERWATER1/160.5M。本专利技术具有如下有益效果：1、在本专利技术中，利用液相色谱-质谱联用仪分别检测至少三种浓度的标准溶液，其中，标准溶液为具有内标物的丙戊酸的标准溶液，且至少三种浓度标准溶液中内标物浓度一致；根据至少三种浓度标准溶液的检测结果，分别拟合丙戊酸的标准曲线方程；对待检测血液进行高速离心处理，并向离心后的上清液中加入与标准溶液中相同量的内标物工作液，在高转速下涡旋振荡混合，再加入沉淀蛋白试剂，并再次进行高速涡旋振荡混合以及高速离心处理，以使溶液混合均匀获得去除干扰物后的上清液，并在上清液中加入一定量的稀释液。利用液相色谱-质谱联用仪检测该稀释后的溶液，基于丙戊酸的第一检测结果和丙戊酸的标准曲线方程，得到待测血液样本中丙戊酸的浓度，实现了检测血液中的丙戊酸，有效地缩短了检测时间。2、在本专利技术中，对待测血液样品的处理方法以及内标物的选择，使得丙戊酸的识别更为准确，分析时间短、干扰小，内标定量适宜特异性强、灵敏度高，同时，回收率，检测限和精密度等各项技术指标均符合要求，同时，该检测血液中丙戊酸的方法，重现性良好，且加样回收率良好，从而提高检测结果的准确度，消除系统误差。附图说明图1是本专利技术一实施例提供的丙戊酸VPA的化学结构式；图2是本专利技术一实施例提供的标准溶液中丙戊酸和丙戊酸-d6的色谱图；图3是本专利技术一实施例提供的标准溶液中丙戊酸和丙戊酸-d6的质谱图；图4是本专利技术一实施例提供的待测血液样本中的丙戊酸和丙戊酸-d6的色谱图；图5是本专利技术一实施例提供的待测血液样本中的丙戊酸和丙戊酸本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测血液中丙戊酸的方法，其特征在于：它包括以下步骤：/n(一)标准溶液的标定/n(a)制备丙戊酸标准储备液/n把购买的有证丙戊酸标准溶液转移至2mL冻存管中，得到1mg/mL的丙戊酸标准储备液，在-80℃条件下保存；/n(b)制备丙戊酸的标准中间液/n用含水量为10％～80％甲醇稀释液稀释上述丙戊酸标准储备液，制成含有浓度为2.5mg/L～160mg/L的丙戊酸的至少三种丙戊酸的标准中间液，并在-80℃条件下保存；/n(c)制备内标工作液/n用含水量为10％～80％甲醇稀释液稀释1mg/mL的丙戊酸-d6储备液，得到一种含有10～50mg/L丙戊酸-d6的内标工作液，并在-80℃条件下保存；/n(d)制备标准溶液/n分别移取10μL上述至少三种浓度的丙戊酸标准中间液，在上述每一种丙戊酸标准中间液中分别加入10μL的内标工作液和180μL含水量为70％甲醇稀释液，并在转速为1000～2000rpm下涡旋混匀30s～1min，制成至少三种不同浓度的标准溶液，其中，每一种浓度的标准溶液中包含的内标物的浓度相同；/n(e)拟合标准曲线方程/n利用液相色谱-质谱联用仪检测上述每一种浓度的标准溶液，得到至少三种不同浓度的标准溶液的丙戊酸和丙戊酸-d6的图谱；从上述每种浓度的标准溶液的图谱中分别得到丙戊酸的色谱峰峰面积和丙戊酸-d6的色谱峰峰面积，分别以上述至少三种不同浓度的标准溶液中的丙戊酸的色谱峰峰面积与丙戊酸-d6的色谱峰峰面积的比值作为标准曲线方程的纵坐标y...

【技术特征摘要】
1.一种检测血液中丙戊酸的方法，其特征在于：它包括以下步骤：
(一)标准溶液的标定
(a)制备丙戊酸标准储备液
把购买的有证丙戊酸标准溶液转移至2mL冻存管中，得到1mg/mL的丙戊酸标准储备液，在-80℃条件下保存；
(b)制备丙戊酸的标准中间液
用含水量为10％～80％甲醇稀释液稀释上述丙戊酸标准储备液，制成含有浓度为2.5mg/L～160mg/L的丙戊酸的至少三种丙戊酸的标准中间液，并在-80℃条件下保存；
(c)制备内标工作液
用含水量为10％～80％甲醇稀释液稀释1mg/mL的丙戊酸-d6储备液，得到一种含有10～50mg/L丙戊酸-d6的内标工作液，并在-80℃条件下保存；
(d)制备标准溶液
分别移取10μL上述至少三种浓度的丙戊酸标准中间液，在上述每一种丙戊酸标准中间液中分别加入10μL的内标工作液和180μL含水量为70％甲醇稀释液，并在转速为1000～2000rpm下涡旋混匀30s～1min，制成至少三种不同浓度的标准溶液，其中，每一种浓度的标准溶液中包含的内标物的浓度相同；
(e)拟合标准曲线方程
利用液相色谱-质谱联用仪检测上述每一种浓度的标准溶液，得到至少三种不同浓度的标准溶液的丙戊酸和丙戊酸-d6的图谱；从上述每种浓度的标准溶液的图谱中分别得到丙戊酸的色谱峰峰面积和丙戊酸-d6的色谱峰峰面积，分别以上述至少三种不同浓度的标准溶液中的丙戊酸的色谱峰峰面积与丙戊酸-d6的色谱峰峰面积的比值作为标准曲线方程的纵坐标y1，以上述至少三种不同浓度的标准溶液中的丙戊酸的浓度与丙戊酸-d6的浓度的比值作为标准曲线的横坐标x1，将上述检测所得的至少三种不同浓度的数据进行线性回归，拟合得到丙戊酸对应的标准曲线方程为：y1＝a*x1+b，并且得到权重系数a和b；
(二)待测血液样本的处理
取待测血液至少2mL，在离心速度3500rpm下离心10min，提取待测血液的上清液，并在-20℃条件下保存；
移取步骤(c)的丙戊酸-d6的内标工作液10μL于1.5mL离心管中，再加入上述待测血液的上清液10μL，在1500rpm的转速下涡旋震荡混合30s，然后再在上述离心管中加入80μL沉淀蛋白试剂，在2000rpm的转速下涡旋震荡混合3min，以达到充分沉淀蛋白的目的，再在10000-15000rpm的转速下高速离心10min，得到上清液，取上清液50μL，加入含水量为70％的甲醇溶液50μ...

【专利技术属性】
技术研发人员：雒琴，贾永娟，倪君君，
申请(专利权)人：北京和合医学诊断技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11