一种多孔网状培养肉生产模具及基于该模具的多孔网状肌肉组织生产方法及其应用技术

本发明专利技术提供一种规律排布微柱阵列的多孔网状培养肉生产模具及基于该模具的多孔肌肉组织生产方法。包括将肌源性细胞和I型胶原、含酚红的DMEM培养基、氢氧化钠溶液，得到含有细胞的混合溶液，将含有细胞的混合溶液加入到模具中，37℃，5％二氧化碳的培养箱中培养2h以形成水凝胶肌肉组织。之后加入生长培养基，水凝胶肌肉组织培养1‑3天之后，将生长培养基换为分化培养基，水凝胶肌肉组织在分化培养基中培养5‑7天后，即得多孔网状肌肉组织。使水凝胶肌肉组织能在微柱之间收缩形成肌肉束，微柱周围由于肌肉束形成的收缩空间可以增强营养物质向细胞的扩散，有利于废弃物排出，并通过控制机械张力的空间格局来引导局部的三维细胞排列，促进分化，实现在体外生产出较大的、符合工业生产的培养肉产品。

A kind of mould for the production of porous mesh cultured meat and the production method of porous mesh muscle tissue based on the mould and its application

【技术实现步骤摘要】
一种多孔网状培养肉生产模具及基于该模具的多孔网状肌肉组织生产方法及其应用
本专利技术属于干细胞和动物细胞培养肉
，具体地，涉及一种多孔网状培养肉生产模具及基于该模具的多孔网状肌肉组织生产方法及其应用。
技术介绍
肉类因含有丰富的蛋白质及脂肪、碳水化合物、矿物质、维生素等营养成分而成为了最重要的副食品之一。然而，世界人口持续增长及发展中国家人均收入增加，推动了肉类需求快速增长。传统畜牧业的扩张会造成森林砍伐和土地退化，环境污染，影响动物福利，威胁人和动物健康等问题。培养肉是指通过培养动物干细胞，在体外分化重组为肉类组织用于食用。通过相应的加工技术，培养肉将具有和普通肉相似的口感，风味和质地。培养肉是将动物蛋白生产从动物水平发展到细胞水平，从而减少了动物本身生存所带来的资源消耗和环境污染，实现肉类高效率绿色生产。培养肉的体外生产中最重要的技术之一就是体外生产肌肉组织。天然骨骼肌含有长而平行的肌束，肌肉束是由密集排列和高度对准的肌纤维组成。体外肌肉组织工程就是模仿体内肌肉的生长情况，在体外通过机械力的牵引或者特定的微型管道来促进肌肉细胞的定向排列形成高度对准的肌纤维。然而，这类方法也存在着缺陷，如微型管道方法只能形成少数几层的肌管细胞，机械力的牵引也仅能使肌肉组织收缩在两个锚钉之间形成单条肌肉束。目前用于培养肉研究和生产的培养肉生产模具有圆柱体单柱型和两个锚点牵引的双柱型模具。利用单柱型模具，可以在圆柱体周围形成紧紧贴住圆柱体的肌肉束，展开后可以形成一条肌肉束。双柱型模具也会在两个柱型锚点间形成一条肌肉束。但由于氧气和其他营养成分以及废物的运输距离极限是100-200um，且一条肌肉束由于力学原因不能过长，因而限制了这两种模具获得较大的肌肉组织，如何提供一种有利于建立较大的且有利于组织营养成分和废弃物交换的培养肉组织的模具，结合改进的培养方法，培养得到较大的用于食用的肌肉组织尤为重要。
技术实现思路
本研究发现，目前用于培养肉研究和生产的培养肉生产模具是圆柱体单柱型和两个锚点牵引的双柱型模具，这两种模具由于力学以及氧气、营养物质运输等原因，所得到的体外肌肉组织较小。由于培养肉的研究和生产需要在体外制作一块相对较大的肌肉组织作为原料肉，因而培养较大的肌肉组织成为培养肉发展的难题。为解决现有技术中的上述技术问题，本专利技术提供一种可以设计成较大尺寸的微柱阵列的多孔网状培养肉生产模具及基于该模具的多孔网状肌肉组织生产方法。本专利技术的第一个目的是提供一种多孔网状培养肉生产模具，所述模具上端开口，包括外壁1、第一凹槽2、第二凹槽3、微柱4；所述外壁1的纵向截面为向下的二级阶梯状，第一级为第一凹槽2的底部，第二级为第二凹槽3的底部。所述第一凹槽2设置在外壁1内侧，第一凹槽主要作用是在第二凹槽加入培养肉所需的混合凝胶细胞培养液之后，第一凹槽还有较大的空间加入培养液，提供适合的培养液储存空间，保证营养的供给。第一凹槽还有利于制备本申请的模具时，从阳模中脱模，帮助模具的制作(阳模可以但不限于通过3D打印获得)。所述第二凹槽3设置在第一凹槽2底部；第二凹槽为主要用于加入培养肉所需混合凝胶的培养区域。所述第二凹槽3底部竖直设置若干个微柱4；所述若干个微柱4规律错位间隔排列形成微柱阵列，微柱阵列的设计考虑了后期混合凝胶培养过程中的力学变化，增强营养物质向细胞的扩散，有利于废弃物排出，并通过控制机械张力的空间格局来引导局部的三维细胞排列，促进分化过程。进一步的，所述微柱4的长度为1～5mm，宽度为0.5～1.5mm，高度为1～5mm。进一步的，微柱4所述的错位间隔排列具体为：相邻行的微柱(4)之间间隔1-3mm，相邻行的微柱(4)平行偏移1-4mm，每行中的各微柱(4)之间间隔0.5-3mm。基于微柱4的该尺寸、排列方式及间隔距离，即使扩大模具尺寸，也能够在培养肉生产过程中，结合含肌源性细胞混合凝胶形成凝胶以及凝胶压实过程中的力学变化，给予氧气和其他营养成分以及代谢废物适宜的运输距离，使凝胶能在不同柱子之间收缩形成肌肉束，微柱周围由于肌肉束形成的收缩空间可以增强营养物质向细胞的扩散，有利于废弃物排出，并通过控制机械张力的空间格局来引导局部的三维细胞排列，促进分化过程，从而获得较大的肌肉组织，这也是实现体外培养较大的网状培养肉组织的关键所在。所述微柱4的行数≥2行；优选的，在以上微柱4的尺寸和排列方式范围内，根据第二凹槽3底部面积尽量多的设置微柱4。进一步的，所述微柱4的横截面为矩形或椭圆形。进一步的，所述模具为上端开口的长方体或者圆柱状体。进一步的，所述第一凹槽2居中设置在外壁1内侧。进一步的，所述第一凹槽2的高度为3-7mm。在该高度范围内，第一凹槽可以提供适合的培养基储存空间，且有利于制备本模具时的脱模。进一步的，所述第一凹槽2的底部宽度为2-4mm。该宽度有利于制备本模具时的脱模。进一步的，所述第二凹槽3居中设置在第一凹槽2底部。进一步的，所述第二凹槽3的高度为2-6mm，即所述第二凹槽3的高度相同或略高于微柱4的高度。进一步的，所述多孔网状培养肉生产模具可以但不限于通过3D打印得到阳模后，利用PDMS浇注法制作得到，优选的，具体制作步骤如下：(1)利用三维绘图软件设计出用于制备该多孔网状培养肉生产模具的阳模，所述的阳模的纵向截面为三阶梯结构，由下而上的第一层阶梯用于形成本专利技术模具的外壁1，第二层阶梯用于形成本专利技术模具的第一凹槽2，第三层阶梯用于形成第二凹槽3和微柱4。阳模的第二层阶梯的高度为3-7mm，所述第三层阶梯的高度为2-6mm，第三层阶梯设置若干个柱状凹槽(用于微柱4生产)，凹槽的排列方式为错位间隔排列，相邻行的凹槽平行偏移1-4mm，凹槽的长宽高为(1-5)×(0.5-1.5)×(1-5)mm，相邻行的凹槽之间间隔1-3mm，每行中的各凹槽之间间隔0.5-3mm，其余长宽尺寸可根据所需制备的多孔网状培养肉生产模具相应调整。(2)利用3D打印机进行阳模的打印，所述的3D打印机为FDM打印机，挤出的丝材可以是PLA、ABS等。(3)利用PDMS浇注法浇筑阳模后，脱模得到所述多孔网状培养肉生产模具；所述PDMS浇注法的操作为，道康宁Sylgard184硅橡胶PDMS的A液和B液的质量比为10:1混合，倒入到阳模中，经脱气和凝固后，将培养肉生产模具较为完整的取出，微柱取出时断裂的数目比例为0％-20％，微柱剩余为90％以上才能用于后续培养肉的生产。将所得的模具经清洗后121℃灭菌15min，取出后烘干备用。更优的，将灭菌后的培养肉生产模具在0.2％(质量体积比)的PluronicF-127溶液中浸泡1小时，以防止水凝胶附着在培养肉生产模具上；之后取出培养肉生产模具，用PBS清洗3遍，晾干待用。3D打印技术是近年来发展迅速的先进制造技术，可以根据需求制造任意特定形状的结构。利用3D打印技术制备的阳模，浇筑、脱模，制造出本申请的具有较大尺寸、规律排布的微柱阵列的培养肉生产模具，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种多孔网状培养肉生产模具，其特征在于，所述模具上端开口，包括外壁(1)、第一凹槽(2)、第二凹槽(3)、微柱(4)；/n所述第一凹槽(2)设置在外壁(1)内侧；/n优选的，所述第一凹槽(2)居中设置在外壁(1)内侧；/n所述第二凹槽(3)设置在第一凹槽(2)底部；/n优选的，所述第二凹槽(3)居中设置在第一凹槽(2)底部；/n所述第二凹槽(3)底部竖直设置若干个微柱(4)，所述若干个微柱(4)错位间隔排列形成微柱阵列；/n优选的，所述若干个微柱(4)错位间隔排列为：相邻行的微柱(4)之间间隔1-3mm，相邻行的微柱(4)平行偏移1-4mm，每行中的各微柱(4)之间间隔0.5-3mm。；/n优选的，所述模具为上端开口的长方体或者圆柱状体。/n

【技术特征摘要】
1.一种多孔网状培养肉生产模具，其特征在于，所述模具上端开口，包括外壁(1)、第一凹槽(2)、第二凹槽(3)、微柱(4)；
所述第一凹槽(2)设置在外壁(1)内侧；
优选的，所述第一凹槽(2)居中设置在外壁(1)内侧；
所述第二凹槽(3)设置在第一凹槽(2)底部；
优选的，所述第二凹槽(3)居中设置在第一凹槽(2)底部；
所述第二凹槽(3)底部竖直设置若干个微柱(4)，所述若干个微柱(4)错位间隔排列形成微柱阵列；
优选的，所述若干个微柱(4)错位间隔排列为：相邻行的微柱(4)之间间隔1-3mm，相邻行的微柱(4)平行偏移1-4mm，每行中的各微柱(4)之间间隔0.5-3mm。；
优选的，所述模具为上端开口的长方体或者圆柱状体。


2.根据权利要求1所述的多孔网状培养肉生产模具，其特征在于，所述微柱(4)的长度为1～5mm，宽度为0.5～1.5mm，高度为1～5mm。


3.根据权利要求1所述的多孔网状培养肉生产模具，其特征在于，所述微柱(4)的横截面为矩形或椭圆形。


4.根据权利要求1所述的多孔网状培养肉生产模具，其特征在于，所述第一凹槽(2)的高度为3-7mm，所述第二凹槽(3)的高度为2-6mm。


5.根据权利要求1所述的多孔网状培养肉生产模具，其特征在于，所述第一凹槽(2)的底部宽度为2-4mm。


6.根据权利要求1所述的多孔网状培养肉生产模具，其特征在于，所述多孔网状培养肉生产模具是通过3D打印得到阳模后，利用PDMS浇注法制作得到的。

【专利技术属性】
技术研发人员：丁世杰，唐文来，周光宏，杨继全，吴中元，朱浩哲，李春保，徐幸莲，
申请(专利权)人：南京农业大学，南京师范大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32