一种β2-微球蛋白单克隆抗体的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种β2‑微球蛋白单克隆抗体的制备方法。该方法首先筛选出免疫原性相对较强的两个多肽表位序列分别作为第一、第二抗原表位，再在第一、第二抗原表位的碳端氨基酸上分别连接1个半胱氨酸，通过SMCC偶联方法将半胱氨酸的巯基与蓝钥蛋白的伯胺基偶联，获得体外合成的β2‑MG双表位多肽抗原；然后利用双表位多肽抗原对小鼠进行常规免疫、分离出脾淋巴细胞与骨髓瘤细胞进行细胞融合；最后筛选出阳性单克隆细胞，经腹腔注射及腹水回收提取出单克隆抗体。本发明专利技术通过对传统单表位抗原免疫方法进行改进，优化了抗原的免疫原性，缩短了免疫周期，提高了免疫阶段的血清效价，从而提升了抗β2‑MG的阳性单克隆抗体获得效率。

Preparation of monoclonal antibody against \u03b2 2-microglobulin

【技术实现步骤摘要】
一种β2-微球蛋白单克隆抗体的制备方法
本专利技术涉及生物
，具体涉及一种β2-微球蛋白单克隆抗体的制备方法。
技术介绍
β2微球蛋白简称β2-MG，是一种源自淋巴细胞、血小板及多形核白细胞分泌的小分子球蛋白，由99个氨基酸组成的单链线性多肽，分子量为11800。β2-MG是HLA-Ⅰ类分子的组成部分，正常人血清中β2-MG的浓度处于0.5-2.0mg/L范围，β2-MG被排泄到体外的唯一脏器为肾脏，当发生肾功能不全时，因β2-MG的排泄障碍导致患者体内血清β2-MG浓度为正常人的60倍，当β2-MG在组织中过度沉积容易诱发β2-MG相关淀粉样病变。研究发现血清中β2-MG的水平与肾小球滤过率(GFR)呈现显著负相关，通过血清中β2-MG变化可以更早的发现肾小球功能受损【1】。目前β2-MG的临床检测方法主要为放射免疫分析法(RIA)和酶联免疫吸附试验(ELISA)，这些方法均需要β2-MG的单克隆或多克隆抗体。但是，由于β2-MG参与形成组织相容性复合体(MHCⅠ和MHCⅡ)或类似二聚体，导致人与小鼠的β2-MG具有一定同源性，因此实施天然抗原免疫融合后的小鼠很难获得较多数量的阳性单克隆抗体【2】【3】。为解决上述问题，传统的方案是对特定目标表位片段氨基酸序列通过真核表达系统体外表达，利用单一抗原表位多肽设计及体外合成的方法实施免疫和杂交瘤融合，但是也很难获得较高数量阳性单克隆抗体，本研究已经给予证实。参考文献1.CalabreseMF,MirankerAD.Formationofastableoligomerofbeta-2microglobulinrequiresonlytransientencounterwithCu(II).JournalofMolecularBiology,2007,367(1)：1-7.2.FreyBF,JiangJ,SuiY,BoydLF,etal.Effectsofcross-presentation,antigenprocession,andpeptidebindinginHIVEvasionofTcellimmunity.JournalofImmunology,2018,200(5):1853-1864.3.JosephW,BeckerandGeorgeN,ReekeJR.Three-dimensionalstructureofβ2-microglobulin.Proc.Natl.AcadSci,1985,82:4225-4229.
技术实现思路
为了克服现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种制备β2-微球蛋白(β2-MG)单克隆抗体的方法。本专利技术基于传统体外合成单一抗原表位偶联载体提高免疫原性方法基础上，实施同一载体连接两个不同的双抗原表位，通过提高免疫原性和有效基团数从而提高免疫效果，在保障合成肽免疫原性的同时，有效提升β2-微球蛋白(β2-MG)单克隆抗体阳性率。本专利技术的技术方案具体介绍如下。本专利技术提供一种β2-微球蛋白单克隆抗体的制备方法，具体步骤如下：(1)基于NCBI平台以及IEDB平台筛选出免疫原性相对较强的两个多肽表位序列IQRTPKIQVYSRHPAEN和YLLYYTEFTPTEK分别作为第一抗原表位和第二抗原表位；(2)在第一抗原表位的末端天冬酰胺N及第二抗原表位的末端酪氨酸Y上分别连接1个半胱氨酸Cys，然后利用SMCC偶联方法将半胱氨酸的巯基与蓝钥蛋白KLH的伯胺基偶联使得两个多肽表位序列同时连接到KLH分子上，作为体外合成的β2-MG双表位多肽抗原；(3)采用β2-MG双表位多肽抗原对8w龄BALb/C小鼠进行3次连续免疫后，在最后一次免疫3天后取其脾脏利用淋巴细胞分离液分离出脾淋巴细胞，并与骨髓瘤细胞SP2/0-Ag14进行细胞融合；细胞融合后采用间接ELISA方法进行筛选，对阳性杂交瘤细胞株使用有限稀释法克隆，得到的抗β2-MG抗体的单克隆细胞经腹腔注射及腹水回收提取出抗β2-MG的单克隆抗体。本专利技术中，步骤(1)中，经web.expasy.org平台中疏水性和表面可接触性指标筛选出免疫原性相对较强的两个多肽表位序列。和现有技术相比，本专利技术的有益效果在于：本专利技术将传统的单一表位免疫方法进行优化为双表位免疫，在保障体外合成多肽抗原表位免疫原性基础上，通过增加抗原表位数，从而有效提升β2-微球蛋白(β2-MG)单克隆抗体阳性率。本方法通过增加抗原表位数，从而实现制备和增加抗β2-MG的单克隆抗体数。与单一表位抗原制备抗β2-MG的单克隆抗体相比，含两个表位的抗原经免疫融合后制备的抗β2-MG的单克隆抗体的数量会进一步得到提升。本专利技术生产的单克隆抗体与β2-MG天然抗原发生特异性反应，且获得了3种不同的特异性单克隆抗体：抗β2-MG多肽表位1的单克隆抗体、抗β2-MG多肽表位2的单克隆抗体、抗β2-MG双表位多肽抗原3的单克隆抗体。附图说明图1是β2-MG的不同抗原表位疏水性得分(Hphop·Kyte&Doolittle)；其中：A、B、C、D、E、F分别是表位序列1#、2#、3#、4#、5#、6#的疏水性得分；1#表位序列YLLYYTEFTPTEK；2#表位序列IQRTPKIQVYSRHPAEN；3#表位序列VTLSQPKIVKWDRDM；4#表位序列AENGKSNFL；5#表位序列HPSDIEVDL；6#DWSFYLLYYTE。图2是β2-MG的不同抗原表位氨基酸的表面可及性。图3β2-MG多肽抗原1组的特异性间接ELISA检测结果。图4β2-MG多肽抗原2组的特异性间接ELISA检测结果。图5β2-MG多肽抗原3组的特异性间接ELISA检测结果。图6β2-MG天然抗原4组的特异性间接ELISA检测结果。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术的技术方案进行详细阐述。本专利技术采用双多肽表位连接同一载体体外合成方法，此方法是基于NCBI平台和IEDB平台，首先，基于NCBI平台www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/3CIQ_L中β2-MG的氨基酸序列以及IEDB平台http://www.iedb.org中β2-MG的理论抗原表位，对其表位信息归类并整理所有理论表位氨基酸序列，经web.expasy.org平台中疏水性(Hphob.Kyte&Doolittle)和表面可及性(％Accessibleresidues)指标筛选，从理论上筛选出免疫原性相对较强的β2-MG抗原多肽表位1(IQRTPKIQVYSRHPAEN)和抗原多肽表位2(YLLYYTEFTPTEK)，根据β2-MG的不同抗原表位氨基酸疏水性(图1)及表面可及性(图2)初步比较，依据疏水性得分越低且表面可触比例越高则免疫原性越好的原则，筛选获得的免疫原性最佳的第一抗原表位和第二抗原表位。为进一步提高多肽抗原表位免疫原性，首先将第一、第二抗原表位的碳端氨基酸分别连接1个半胱本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种β2-微球蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：/n(1)基于NCBI平台以及IEDB平台筛选出免疫原性相对较强的两个多肽表位序列IQRTPKIQVYSRHPAEN和YLLYYTEFTPTEK分别作为第一抗原表位和第二抗原表位；/n(2)在第一抗原表位的末端天冬酰胺N及第二抗原表位的末端酪氨酸Y上分别连接1个半胱氨酸Cys，然后利用SMCC偶联方法将半胱氨酸的巯基与蓝钥蛋白KLH的伯胺基偶联使得两个多肽表位序列同时连接到KLH分子上，作为体外合成的β2-MG双表位多肽抗原；/n(3)采用β2-MG双表位多肽抗原对8w龄BALb/C小鼠进行3次连续免疫后，在最后一次免疫3天后取其脾脏利用淋巴细胞分离液分离出脾淋巴细胞，并与骨髓瘤细胞SP2/0-Ag14进行细胞融合；细胞融合后采用间接ELISA方法进行筛选，对阳性杂交瘤细胞株使用有限稀释法克隆，得到的抗β2-MG抗体的单克隆细胞经腹腔注射及腹水回收提取出抗β2-MG的单克隆抗体。/n

【技术特征摘要】
1.一种β2-微球蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：
(1)基于NCBI平台以及IEDB平台筛选出免疫原性相对较强的两个多肽表位序列IQRTPKIQVYSRHPAEN和YLLYYTEFTPTEK分别作为第一抗原表位和第二抗原表位；
(2)在第一抗原表位的末端天冬酰胺N及第二抗原表位的末端酪氨酸Y上分别连接1个半胱氨酸Cys，然后利用SMCC偶联方法将半胱氨酸的巯基与蓝钥蛋白KLH的伯胺基偶联使得两个多肽表位序列同时连接到KLH分子上，作为体外合成的β2-MG双表位多肽抗原；
(3)采用β...

【专利技术属性】
技术研发人员：高健，陈旭华，汪渊，谌敦华，
申请(专利权)人：上海钹乐诗生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31