一种真菌菌丝生物量的测定方法技术

本发明专利技术属菌丝生物量测定方法技术领域，特别涉及一种真菌菌丝生物量的测定方法，包括如下步骤：(1)载玻片处理：将基础溶液浸湿的介质纸片贴于马铃薯基质片上，然后贴于圆形载玻片上，置于培养皿内，并向培养皿内加注基础溶液至淹没介质纸片，盖上盖子，高压灭菌；(2)接种元处理：将接种元经高压灭菌，冷却至室温，后用真菌纯培养液浸湿；(3)接种、培养；(4)检测：培养数日，用镊子将附有菌丝的介质纸片与马铃薯基质片分离，然后脱水干燥、称重；本发明专利技术的菌丝生物量测定方法具有操作简便、测定精确、成本低、计算方式简单、可重复性强、测定范围广、结果偏差小的特点。

A method for the determination of mycelial biomass of fungi

【技术实现步骤摘要】
一种真菌菌丝生物量的测定方法
本专利技术属菌丝生物量测定方法
，特别涉及一种真菌菌丝生物量的测定方法。
技术介绍
生物量是所有微生物生长状况的一项基本参数，其测定是确定微生物培养过程的生长动力学和深入研究微生物代谢调控的基础。由于多数微生物与其生长基质的混合特性，很难直接测定其生物量。目前，常用的测定方法主要有两种：(1)根据菌落直径大小判断，但准确性差，仅起定性判断作用；(2)采用液体培养、过滤、干燥称量判断，虽然精确高但实验繁琐复杂。另外，如专利号CN201110236660.6公开了一种固态发酵真菌生物量的在线原位监测方法。其特征在于：使用生产菌株在反应器外进行发酵试验，拍摄不同发酵阶段的菌体-基质图像，通过数字图像处理求得分形维数，同时用化学法测定相应的菌体生物量，计算分形维数与菌体生物量之间的函数关系；使用反应器中内置摄像头拍摄固态发酵过程菌体生长图像并计算其分形维数，根据分形维数-生物量函数关系可得相应生物量。该专利技术可实现固态发酵真菌生物量在线监测，促进固态发酵自动化控制。但该方法计算方式复杂，使用设备分辨率要求高。又如专利号CN201310305536.X公开了一种重金属胁迫下黄孢原毛平革菌活细胞生物量的检测方法，包括以下步骤：(1)菌球培养：将黄孢原毛平革菌加入液态培养基中进行恒温培养，然后加入重金属溶液进行胁迫处理；(2)显色反应：取上述重金属胁迫后得到的黄孢原毛平革菌菌球加入到无菌噻唑蓝溶液中，于30℃～50℃下进行显色反应0.5h～4h，然后迅速加入盐酸溶液终止反应，得到反应后的混合液；(3)离心处理：将混合液离心处理，去除上清液，得到下层沉淀物；(4)萃取检测：向沉淀物中加入萃取剂进行萃取，测定所得萃取液的吸光度，计算重金属胁迫下黄孢原毛平革菌的活细胞生物量；但该检测方法对仪器要求严苛，仪器的维护及清洁成本高。因此，研究一种精确度高、步骤简化、成本低的检测方法对真菌菌丝生物量的检测具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术为解决上述技术问题，提供了一种真菌菌丝生物量的测定方法。具体是通过以下技术方案来实现的：一种真菌菌丝生物量的测定方法，包括如下步骤：(1)载玻片处理：将基础溶液浸湿的介质纸片贴于马铃薯基质片上，然后共同再贴放于圆形载玻片上使得介质纸片朝上，再将圆形载玻片倾斜20-25°固定于支架上，然后放置于培养皿内，并向培养皿内加注基础溶液至淹没介质纸片0.3-0.7cm，盖上盖子，高压灭菌28-35min；(2)接种元处理：将接种元经高压灭菌28-35min，于无菌条件下冷却至室温，然后将接种元用真菌纯培养液浸湿；(3)接种、培养：用接种针挑取接种元接种于介质纸片上，盖上盖子，于恒温恒湿环境下静置培养；(4)检测：培养数日，用镊子将附有菌丝的介质纸片与马铃薯基质片分离，然后将附有菌丝的介质纸片脱水干燥、称重，除去介质纸片重量即得菌丝生物量。所述基础溶液包括碳源、氮源、无机盐、水组成。所述碳源和氮源和无机盐的总物质浓度为25-40g/L。所述碳源为葡萄糖、鼠李糖、麦芽糖、可溶性淀粉、柠檬酸、脂肪酸、纤维素、木质素中任意一种或多种混合物。所述氮源为鱼骨粉、花生粉、麸皮、蛋白胨、玉米浆中任意一种或多种混合物。所述介质纸片是用中速双圈定性滤纸剪成与圆形载玻片同面积的纸片。所述介质纸片在基础溶液浸湿前，用淀粉/酸乙烯酯接枝共聚物对介质纸片进行浸湿处理；所述淀粉/醋酸乙烯酯接枝共聚物的制备方法为：称取淀粉5g与去离子水200mL混合并在混合过程中升温制成糊化淀粉，同时向体系中通入氮气，加入十二烷基硫酸钠3g混合3-5min，滴加过硫酸钾0.25g、乙酸钠0.2g和醋酸乙烯酯5g，并在45min内滴加完后，于温度为70-80℃条件下反应2-3h，然后加入阻聚剂终止反应，冷却至常温。所述马铃薯基质片是将马铃薯洗净去皮，切成与圆形载玻片同面积的马铃薯片。所述马铃薯基质片上铺设有厚度50-70μm的硅藻土与碳化硅混合层。所述硅藻土与碳化硅混合层的质量比为硅藻土：碳化硅＝(1.3-2.3)：1。所述接种元是用打孔器将滤纸制成圆片，装在试管内用胶塞塞紧管口。所述真菌纯培养液按如下重量份组成：玉米粉3.5-4.8份、麦麸粉2.3-3.1份、尿素1.2-2.2份、硫酸铵0.8-1.6份、维生素C0.3-0.9份、维生素K0.1-0.7份、磷酸铁0.2-0.6份、磷酸锌0.1-0.5份、水8-10份、啤酒酵母发酵液4.5-6.5份。有益效果：我们通过大量实验证明：本专利技术的菌丝生物量测定方法具有操作简便、测定精确、成本低、计算方式简单、可重复性强、测定范围广、结果偏差小的特点，为实验室分析不同培养条件下菌丝生物量的测定提供了便捷、高效方法。本专利技术的检测过程中仪器设备少、操作简便、未使用如分光计等高精密度仪器，可检测多种真菌菌丝生物量、应用范围广且实用性高。本专利技术通过在马铃薯培养基上铺设硅藻土与碳化硅混合层，起到了隔热、遮光的效果，进而避免了温度、光照等外部条件对菌丝生长、培养液组分造成严重影响而使得测量值下降。本专利技术通过利用淀粉/酸乙烯酯接枝共聚物对介质纸片进行浸湿处理，使得介质纸片容易吸附基础溶液，有助于菌丝培养，同时提高了介质纸片的耐破能力，使得介质纸片称量更准确，有效提高了测量精确度以及实现了介质纸片的回收再用。本专利技术通过优化真菌培养液，尤其在培养液中加入了维生素C、维生素K以及磷酸铁、磷酸锌，促进了菌丝的快速生长，缩短了培养时间，约培养2日后即可测试，还适应了多种真菌的培养。附图说明图1为实施例1培养皿俯视图；图2为实施例2培养皿侧视图。其中，1-培养皿，2-载玻片，3-支架。具体实施方式下面对本专利技术的具体实施方式作进一步详细的说明，但本专利技术并不局限于这些实施方式，任何在本实施例基本精神上的改进或代替，仍属于本专利技术权利要求所要求保护的范围。对照组1-4对照组1-4分别提供了担子菌松乳菇真菌、黑曲霉真菌、绿木霉真菌、黄孢原毛平革菌真菌的菌丝生物量的检测方法，具体如下：检测前准备如下：①接种元制备：用打孔器将滤纸制成直径0.3cm圆片，装在试管内用胶塞塞紧管口；②培养皿：内径(直径)14cm,皿深4.5cm；③圆形载玻片：直径6.4cm；④固定圆形载玻片支架：等边4cm三角形支架高4cm；⑤马铃薯基质片：马铃薯洗净去皮，切成与圆形载玻片同面积、厚度0.2cm的马铃薯片；⑥纸质介质：用中速双圈定性滤纸剪成与圆形载玻片同面积的纸片；⑦基础溶液：碳源和氮源和无机盐的总物质浓度为30g/L；碳源为葡萄糖；氮源为玉米浆。检测方法：S1载玻片处理：将基础溶液浸湿的介质纸片贴于马铃薯基质片上，然后共同再贴放于圆形载玻片上使得介质纸片朝上，再将圆形载玻片倾斜20°固定于支架上，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种真菌菌丝生物量的测定方法，其特征在于，包括如下步骤：/n(1)载玻片处理：将基础溶液浸湿的介质纸片贴于马铃薯基质片上，然后共同再贴放于圆形载玻片上使得介质纸片朝上，再将圆形载玻片倾斜20-25°固定于支架上，然后放置于培养皿内，并向培养皿内加注基础溶液至淹没介质纸片0.3-0.7cm，盖上盖子，高压灭菌28-35min；/n(2)接种元处理：将接种元经高压灭菌28-35min，于无菌条件下冷却至室温，然后将接种元用真菌纯培养液浸湿；/n(3)接种、培养：用接种针挑取接种元接种于介质纸片上，盖上盖子，于恒温恒湿环境下静置培养；/n(4)检测：培养数日，用镊子将附有菌丝的介质纸片与马铃薯基质片分离，然后将附有菌丝的介质纸片脱水干燥、称重，除去介质纸片重量即得菌丝生物量。/n

【技术特征摘要】
1.一种真菌菌丝生物量的测定方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)载玻片处理：将基础溶液浸湿的介质纸片贴于马铃薯基质片上，然后共同再贴放于圆形载玻片上使得介质纸片朝上，再将圆形载玻片倾斜20-25°固定于支架上，然后放置于培养皿内，并向培养皿内加注基础溶液至淹没介质纸片0.3-0.7cm，盖上盖子，高压灭菌28-35min；
(2)接种元处理：将接种元经高压灭菌28-35min，于无菌条件下冷却至室温，然后将接种元用真菌纯培养液浸湿；
(3)接种、培养：用接种针挑取接种元接种于介质纸片上，盖上盖子，于恒温恒湿环境下静置培养；
(4)检测：培养数日，用镊子将附有菌丝的介质纸片与马铃薯基质片分离，然后将附有菌丝的介质纸片脱水干燥、称重，除去介质纸片重量即得菌丝生物量。


2.如权利要求1所述真菌菌丝生物量的测定方法，其特征在于，所述基础溶液包括碳源、氮源、无机盐、水组成。


3.如权利要求1所述真菌菌丝生物量的测定方法，其特征在于，所述碳源和氮源和无机盐的总物质浓度为25-40g/L。


4.如权利要求1所述真菌菌丝生物量的测定方法，其特征在于，所述碳源为葡萄糖、鼠李糖、麦芽糖、可溶性淀粉、柠檬酸、脂肪酸、纤维素、木质素中任意一种或多种混合物。

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【专利技术属性】
技术研发人员：易筑刚，蔡静云，
申请(专利权)人：遵义市林业科学研究所，
类型：发明
国别省市：贵州;52